缺血性腦卒中患者環氧化酶-1、-2基因多態性與阿司匹林抵抗的關系

胥麗霞 楊改清 官瑞磊 李曉昶 (鄭州大學附屬鄭州中心醫院，河南 鄭州 450000)

缺血性腦卒中患者環氧化酶-1、-2基因多態性與阿司匹林抵抗的關系

胥麗霞 楊改清 官瑞磊 李曉昶 (鄭州大學附屬鄭州中心醫院，河南 鄭州 450000)

目的探討環氧化酶(COX)的基因多態性與阿司匹林抵抗(AR)的關系。方法選取缺血性腦卒中(IS)患者300例，依據血小板聚集率分為阿司匹林敏感組(AS組，180例)、阿司匹林半抵抗組(ASR組，84例)和AR組(36例)；比較3組一般臨床資料，采用光比濁法檢測血小板聚集率。應用聚合酶鏈反應(PCR)和限制性片段長度多態性(RFLP)技術檢測COX基因多態性，并比較兩組基因型和等位基因分布差異。結果AR組與ASR組COX-1上A-842/C50T有統計學差異(P<0.05)，而COX-2-765G>C(rs20417)無統計學差異(P>0.05)。結論COX-1上的T等位基因是其突變基因，C/T和TT突變會增加AR的風險，而COX-2-765G>C的基因突變與AR無相關性。

環氧化酶；基因多態性；阿司匹林抵抗；血小板聚集率

阿司匹林是缺血性腦卒中一級預防和二級預防的治療基石〔1〕，能明顯降低缺血性心腦血管事件的發生率和再發率〔2〕。但臨床中仍有一部分患者出現阿司匹林抵抗(AR)〔3〕。目前對AR的定義均缺乏敏感性、特異性和可重復性〔4〕。在腦梗死患者中AR發生率高達44%〔5〕。本文旨在探討缺血性腦卒中患者AR與環氧化酶(COX)基因多態性的關系。

1 對象與方法

1.1對象 收集2013年1月1日至2015年10月1日在鄭州大學附屬鄭州中心醫院住院的缺血性腦卒中患者300例，均符合全國第四屆腦血管病學會修訂的診斷標準〔6〕，并經顱腦計算機斷層掃描(CT)或核磁共振成像(MRI)證實。排除標準：(1)有出血傾向；(2)凝血功能異常；(3)血小板≤100×109/L或≥300×109/L；(4)近4 w有大的外科手術；(5)近1個月內使用非甾體類抗感染藥、西洛他唑、雙嘧達莫(潘生丁)、華法林、低分子肝素等影響血小板功能的藥物；(6)合并肝腎功能障礙或嚴重感染；(7)同時使用除阿司匹林以外的其他抗血小板聚集藥物；(8)阿司匹林禁忌者。本研究經鄭州市倫理委員會批準。患者知情同意。所有研究對象服用拜阿司匹林片(德國拜耳制藥公司)100 mg每晚1次，7 d后行血小板聚集率檢測。收集一般臨床資料，包括年齡、性別、既往史(高血壓、糖尿病、心臟病及腦梗死)、血常規、血脂、空腹血糖等。

1.2分組與方法 血小板聚集率采用光比濁法測定。服藥7 d后采集患者晨起空腹肘靜脈血2～3 ml，血液標本置于枸櫞酸抗凝血管中(1∶9)，1 000 r/min離心8 min，之后3 000 r/min離心15 min，先后得到富血小板血漿和乏血小板血漿。檢測血小板聚集率的誘導劑有二磷酸腺苷(ADP)和花生四烯酸(AA)。依據血小板聚集率分為AR組36例、阿司匹林半抵抗(ASR)組84例和阿司匹林敏感(AS)組180例。10 μmol/L ADP誘導的血小板聚集率≥70%且500 μmol/L AA誘發的血小板聚集率≥20%為AR，符合二者之一者為ASR，10 μmol/L ADP誘導的血小板聚集率<70%且500 μmol/L花生四烯酸AA誘發的血小板聚集率<20%為AS。3組一般臨床資料無明顯差異(P>0.05),具有可比性。見表1。

表1 3組一般臨床資料比較

1.3基因提取與測序

1.3.1DNA提取 DNA提取采用酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)方法，采集患者晨起空腹肘靜脈血2 ml，采血試管內含有枸櫞酸鈉，應用DNA提取試劑盒(QIAGNE公司)，提取全血標本DNA，-80℃保存備用。

1.3.2聚合酶鏈反應(PCR)和限制性片段長度多態性(RFLP)技術檢測 COX-1上A-842G/C50T引物：上游5′-GGTGCCCGGTGGGGAATTTT-3′，下游5-GAGGGGAAAGGAGGGGGTTG-3′，擴增長度245 bp，包含SmuI酶切片段。COX-2上-765G>C引物：上游5′-ATTCTGGCCATCGCCGCTTC-3′，下游5′-CTCCTTGTTTCTTGGAAAGAGACG-3′，擴增長度157 bp，包含 Bsh 1236I 酶切片段。并采用 RFLP技術檢測其基因多態性。COX-1擴增產物采用SmuI酶切；COX-2擴增產物采用Bsh 1236I酶切。

1.4統計學方法 應用SPSS18.0軟件進行t、χ2檢驗、Logistic回歸分析。

2 結 果

COX-1 A-842/C50T有C/C、C/T、和T/T 3種基因型。CC基因型(野生型)的擴增產物可被完全切斷，電泳可見120 bp和125 bp的兩條片段(因為距離非常近，因此常可見一個條帶)；CT基因型為雜合子，可見245 bp、120 bp和125 bp 3條片段；TT基因型(突變純合子)不能被酶切斷，僅見 245 bp一條片段。見圖1。

COX-2-765G/C有G/G、G/C和C/C 3種基因型。G/G基因型(野生型)的擴增產物可被完全切斷，電泳可見134 bp片段(23 bp片段在瓊脂糖凝膠中不顯影)；G/C基因型為雜合子，可見157 bp和134 bp 2條片段；C/C基因型(突變純合子)不能被酶切斷，僅見157 bp 1條片段。見圖2。

ASR和AR組T等位基因頻率均高于AS組；COX-1 C50T基因型在AS與ASR組、AS組與AR組差異有統計學意義(χ2=6.897,7.052;P=0.012，0.007)。COX-2上-765G>C的G和C等位基因在3組之間分布平衡，基因型G/G、G/C、C/C在3組之間也無統計學差異(P>0.05)。見表2。

圖1 COX-1 A-842/C50T

圖2 COX-2-765G/C

組別n等位基因頻率(COX?1C50T)CT基因型頻率(COX?1C50T)C/CC/TT/T等位基因頻率(COX?2?765G>C)GC基因型頻率(COX?2?765G>C)G/GG/CC/CAS組180120(667)60(333)95(528)72(400)13(72)162(900)18(100)162(900)12(167)6(33)ASR組8452(619)32(381)42(500)1)34(405)1)8(95)1)73(869)11(131)71(845)8(95)5(60)AR組3621(583)1)15(417)1)18(500)1)15(417)1)3(83)1)29(806)7(194)29(806)4(111)3(83)

與AS組比較：1)P<0.05

3 討 論

心腦血管患者服用阿司匹林，可以降低25%的再發心腦血管事件的風險〔2〕。有薈萃分析指出，阿司匹林不敏感者心腦血管事件的發生率是AS者的3.8倍〔7〕。然而，AR的主要原因在于依從性差〔8〕。英國的一項研究指出，在排除可依從性因素后，AR的發生率可降至25%〔4〕。美國弗明漢心臟病研究發現，基因變異是血小板聚集的決定性因素〔9〕。在動脈硬化性梗死灶中，存在COX過度表達現象〔10〕。但是，關于AR和COX基因多態性研究的結論卻不盡相同。這可能和研究對象的種族不一致或試驗研究方法差異有關。目前臨床和實驗室中，檢測血小板聚集率的方法多種多樣〔11〕。目前沒有一個統一的方法和標準，也是造成AR發生率在各個研究中差異較大的原因。本研究采用AA和ADP兩種誘導劑來檢測血小板聚集率，可以減少其誤差、提高可精確率。

COX包括COX-1和COX-2，在血小板聚集方面，以COX-1的功能為主〔12〕。在實驗室和臨床試驗中發現，低劑量的阿司匹林即可不可逆地抑制COX-1的活性，而COX-2卻難以被抑制〔13〕。Agúndez等〔14〕對多種種族的人群研究發現，在歐洲人群中，與阿司匹林有關的COX-1基因位點是rs3842787和rs5789，而俄羅斯人是rs3842789和rs384292，提示各種族基因的差異可能是研究結果差異的原因之一。C50T基因片段位于第17位點，是調節阿司匹林治療反應程度的決定性因素，COX-1上C50T基因片段的變異性在亞洲人群的發生率較低〔15〕。本試驗結果提示T等位基因可能是AR的重要原因之一。

關于COX-2上-765G>C基因型分布，本試驗提示G到C的變異不會增加AR的發生，這與相關研究結論均一致〔16〕。然而，也有研究〔17〕提示，-765G>C(rs20417)與AR顯著相關。本研究提示COX-1上C50T基因突變會增加AR風險，為臨床選擇抗血小板聚集藥物提供一定的參考依據。

1Baigent C，Blackwell L，Collins R，etal.Aspirin in the primary and secondary prevention of vascular disease：collaborative meta-analysis of individual participant data from randomized trials〔J〕.Lancet，2009；373(9678)：1849-60.

2Baigent C,Sudlow C,Collins R,etal.Collaborative meta-analysis of randomised trials of antiplatelet therapy for prevention of death，myocardial infarction，and stroke in high risk patients〔J〕.BMJ，2002；324(7329)：71-86.

3王小東，張代富.血小板功能及抗血小板藥物療效檢測的研究進展〔J〕.同濟大學學報·醫學版，2011；32(4)：120-4.

4Shantsila E,Lip GY′.Aspirin resistance′or treatment non-compliance：Which is to blame for cardiovascular complications〔J〕?J Transl Med,2008；6(1)：47-51.

5林志堅，莊 君，趙 靜，等.腦梗死患者抗血小板藥物抵抗的發生率及相關因素研究〔J〕.醫學研究雜志，2014；43(9)：66-8.

6中華神經科學會中華神經外科學會.各類腦血管疾病診斷要點〔J〕.中華神經科雜志，1996；29(6)：379-80.

7Krasopoulos G，Brister SJ，Beattie WS，etal.Aspirin ′resistance′ and the risk of cardiovascular morbidity：systematic review and meta-analysis〔J〕.BMJ，2008；336(7637)：195-8.

8Kenneth A，Schwartz MD.Aspirin resistance：a clinical review focused on the most common cause，noncompliance〔J〕.Neurohospitalist，2011；1(2):94-103.

9O′Donnell CJ，Larson MG，Feng D，etal.Genetic and environmental contributions to platelet aggregation：the framingham heart study〔J〕.Circulation，2001；103(25)：3051-6.

10Song J，Sumiyoshi S，Nakashima Y，etal.Overexpression of heme oxygenase-1 in coronary atherosclerosis of Japanese autopsies with diabetes mellitus：hisayama study〔J〕.Atherosclerosis，2009；202(2)：573-81.

11Grove EL，Storey RF，Wurtz M.Platelet function testing in atherothrombotic disease〔J〕.Curr Pharm Des，2012；18(33)：5379-91.

12Rocca B，Secchiero P，Ciabattoni G，etal.Cyclooxygenase-2 expression is induced during human megakaryopoiesis and characterizes newly formed platelets〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，2002；99(11)：7634-9.

13Patrignani P.Aspirin insensitive eicosanoid biosynthesis in cardiovascular disease〔J〕.Thromb Res，2003；110(5-6)：281-6.

14Agúndez JA，Martínez，Pérez-Sala D，etal.Pharmacogenomics in aspirin intolerance〔J〕.Curr Drug Metab，2009；10(9)：998-1008.

15Li XL，Cao J，Fan L，etal.Genetic polymorphisms of HO-1 and COX-1 are associated with aspirin resistance defined by light transmittance aggregation in chinese han patients〔J〕.Clin App Thromb Hemost，2013；19(5)：513-21.

16彭玲玲，蔡業峰，招遠祺，等.環氧化酶1與2基因多態性與缺血性腦卒中患者阿司匹林抵抗的相關性研究〔J〕.中國臨床藥理學，2014；30(3)：167-70.

17郭文潔，毛詩賢，張德炳，等.環氧化酶2基因rs689466位點與腦梗死患者阿司匹林抵抗的關系〔J〕.實用醫學雜志，2016；32(13)：2079-83.

R743.32

A

1005-9202(2017)24-6081-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.24.032

鄭州市衛生局課題(No.122102310110)

楊改清(1966-)，女，醫學博士，主任醫師，主要從事腦血管、癲癇及睡眠障礙疾病研究。

胥麗霞(1984-)，女，碩士，主治醫師，主要從事腦血管病和神經系統變性疾病研究。

〔2017-04-11修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)