新城疫病毒在雞胚成纖維細胞中的培養及純化

張玉霞，袁小遠，孟 凱，王友令

(山東省農業科學院 家禽研究所，山東 濟南 250100)

新城疫病毒在雞胚成纖維細胞中的培養及純化

張玉霞，袁小遠，孟 凱，王友令

(山東省農業科學院 家禽研究所，山東 濟南 250100)

利用雞胚成纖維細胞對新城疫毒株GM0511株進行增殖培養和蝕斑法純化，通過對最適細胞密度、病毒最佳接種濃度、覆蓋瓊脂糖濃度、蝕斑形成時間等條件進行優化摸索，最終獲得產斑時間一致，蝕斑大小一致、出斑整齊的純化新城疫毒株，并使原病毒血凝效價提高2個滴度，為后續實驗奠定基礎。

新城疫病毒； 雞胚成纖維細胞； 蝕斑純化

近年來，科研工作者在新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)遺傳變異、進化流行趨勢及疫苗開發利用等方面做了大量的工作，而獲取大量純化的NDV的流行株是開展這些工作的基礎與前提。研究發現，由于疫苗的普遍使用和野毒株的廣泛存在，從臨床發病雞體內分離到的NDV毒株混合現象非常普遍[1]。因此，對多種新城疫毒株進行簡單有效的分離和純化是當前必須面對的問題，用雞胚成纖維細胞(CEF)進行蝕斑純化是一種有效的手段被廣泛使用。本試驗為進一步提高毒株的純化效果，以本實驗室分離到的新城疫GM0 811株為母毒株，從CEF密度、病毒接種濃度、瓊脂糖使用濃度等幾個方面進行優化摸索，為獲得理想的純化ND毒株和后續實驗奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

9～10日齡SPF雞胚，來自山東省家禽研究所SPF雞場。新城疫病毒GM0 811株為本科室自行分離，經HA及HI實驗鑒定為新城疫病毒。一次性6孔細胞培養板來自美國康寧公司；0.22 μm針孔濾器來自Millipore公司。DMEM高糖培養液、0.25%胰酶及小牛血清均為Hyclone產品；瓊脂糖為Oxoid 100 g原裝產品；0.1%中性紅溶液、2×MEM溶液液等其他所需溶液均為自行配制。

1.2 方法

1.2.1 雞胚成纖維細胞制備

根據相關參考文獻[2-3]，取發育良好的9～10日齡SPF雞胚，無菌去殼取胚體，并依此剪掉頭、四肢及內臟，用無菌PBS溶液漂洗3次，去除紅細胞。用無菌眼科剪將洗凈的胚體剪碎，倒入適量的0.25%胰酶37 ℃水浴消化約30 min，期間搖晃震蕩數次，觀察消化液呈白色粘稠狀有拉絲現象時，可置入含5%血清的DMEM培養液中終止消化，充分吹打分散細胞團塊，用200目細胞篩過濾，可得到雞胚成纖維細胞懸液。計數后稀釋成5×105個·mL-1后，接種于6孔細胞培養板內，每孔接種5 mL混勻的細胞懸液。置5% CO2培養箱37 ℃培養。

1.2.2 接毒濃度摸索

將鑒定合格的新城疫尿囊液凍融3次，用一次性0.22 μm針孔濾器過濾，用DMEM高糖培養液將病毒液10倍倍比稀釋成10-1～10-10靜置待用[4-5]。將長成良好細胞單層的雞胚成纖維細胞棄去原培養液，用無菌PBS洗滌2次以去除殘留的血清，將稀釋好的病毒液10-1～10-10分別加入2個6孔培養板，每個稀釋度1孔，每孔0.9 mL，最后一孔加等量的無血清DMEM培養液做對照。置入37 ℃ CO2培養箱吸附1 h，期間每隔15 min搖晃1次，使之均勻接觸細胞。1 h后，吸棄病毒液，PBS洗去未吸附的病毒粒子。

1.2.3 瓊脂糖覆蓋液的準備

預先準備好A液和B液。配方如下。A液(100 mL)：pH值7.2的2×MEM溶液95 mL，小牛血清 5.0 mL，混勻過濾，置37 ℃預熱。B液(100 mL)：根據參考文獻共準備4個濃度，1.6 g、1.8 g、2.0 g、2.2 g瓊脂糖，分別溶于100 mL的PBS液中，121.3 ℃高壓滅菌15 min后，在液體狀態下置56 ℃水浴待用。將預熱的A液分別與B液分別取等量混合，制成4種不同濃度的瓊脂糖最終覆蓋液，每種濃度加入一塊上述處理好的6孔培養板中，2 mL每孔，操作過程中盡量避免氣泡產生。待覆蓋液冷卻凝固后置37 ℃的CO2培養箱，并逐日觀察細胞病變(cytopathic effect，CPE)。

1.2.4 蝕斑染色

待出現CPE時，向各培養板中加第2層含0.01%中性紅的瓊脂糖，每孔1 mL，操作同上。凝固后，將培養板倒置，放入37 ℃ CO2培養箱繼續培養，4 h或過夜后觀察細胞蝕斑情況。

1.2.5 細胞培養特性觀察并挑斑

待培養板中出現清晰的蝕斑時，將200 μL槍頭剪去頭部高壓滅菌，選擇蝕斑數較少，斑與斑間距較大的平板進行底部標記，連同瓊脂糖一起吸取并置入1 mL PBS溶液中，搖晃分散，凍融3次，3 000 r·min-1離心10 min，取上清，記為Clone1，于-20 ℃保存備用。將Clone1毒株稀釋后再次按上述方法接種雞胚成纖維細胞，蝕斑純化3次。并分別將純化后的病毒接種SPF雞胚，對其收獲的尿囊液進行常規HA效價檢測。

2 結果

試驗發現，制備的分散細胞懸液過夜后可長成形態均勻的細長型雞胚成纖維細胞，并基本鋪滿培養板底部。接種病毒的時間依據細胞具體情況而定，太早細胞層太薄容易脫落，太遲則可能影響蝕斑形成。本試驗在細胞培養24 h左右接種病毒，覆蓋中性紅瓊脂糖過夜后則形成了可見的蝕斑(圖1)。不同濃度的病毒液接種細胞后蝕斑形成情況差異較大，和病毒滴度成正相關，濃度越高，蝕斑越多，甚至連成片，滴度越低，蝕斑越少。瓊脂糖的濃度對本實驗的操作也至觀重要，太稀則不宜凝固，太濃則凝固過快不能形成均勻薄層。本實驗接種的新城疫毒株GM0811第一次接種后形成大小不等的蝕斑，出斑時間不一。第三次克隆后10-5病毒液接種均能出現清晰的紅色蝕斑，出斑時間一致，大小整齊，各斑間距1 cm左右。純化后病毒接種雞胚復壯后后，血凝HA效價從原來的7log2左右提高到9log2，雞胚死亡時間集中，血凝效價穩定。

圖1 GM0 811株在CEF細胞上的增殖

3 討論

3.1 最佳細胞濃度

雞胚成纖維細胞生長速度較快，以長成密度稍高的單層為佳，太空了在洗滌時細胞層容易從培養板上脫落，或者因無細胞形成的空洞與病毒形成的蝕斑較易混淆。密度太高了則容易多層細胞積聚在一起，導致有蝕斑形成的地方可能會因底層細胞沒有感染而無法形成可見蝕斑。

3.2 病毒最佳接種稀釋倍數

最佳稀釋倍數需要根據病毒毒力進行摸索調整，一般蝕斑形成能力與毒力成正相關，毒力越強的病毒蝕斑形成能力越強，如果接種稀釋倍數過低，則蝕斑形成太大，容易連成片，不好進行挑斑，如果毒力較弱，而接種稀釋倍數過高，則不宜形成蝕斑，無法進行病毒純化。先摸索感染稀釋度，毒價較低的時候，適當降低稀釋倍數，這與文獻報道[6-7]相一致。低毒力的新城疫毒株在復制時，前體糖蛋白F0敏感性較低，裂解為F1和F2的能力較弱，加入適量的胰酶可增強病毒粒子的感染性，因此，可以在覆蓋瓊脂中加入適量的胰酶或鎂離子增強細胞的蝕斑形成能力。

3.3 瓊脂糖最佳濃度

瓊脂糖是從瓊脂中去除了對細胞有害的物質后提煉而來，能將病毒粒子固定于某個位置形成局限性病灶。瓊脂糖的濃度配比對蝕斑純化實驗操作較大影響，濃度過高則在操作過程中凝固過快，過低則凝固過慢，均影響實驗操作。不同廠家生產的瓊脂糖硬度也不同，本實驗所用以1.8%最佳。

蝕斑技術主要用于病毒的純化，其原理是由于病毒的遺傳變異，一般的病毒株都是由許多特性不一的病毒粒子組成的混雜群體，通過蝕斑技術，選育出性狀相同、產斑條件和產斑時間相同的克隆株，來保證所需毒株的免疫原性及毒力特性穩定。該技術適用于多種病毒的純化。在具體的毒株純化操作中，要根據毒株毒力不同，混合情況不同，所用試劑供應廠家不同等對實驗條件逐步進行優化摸索。

[1] 崔治中. 免疫抑制性病毒多重感染在雞群疫病發生和流行中的作用[J]. 畜牧獸醫學報, 2003, 34(5):417-421.

[2] 殷震, 劉景華. 動物病毒學 [M]. 2版.北京：科學出版社, 1997.

[3] 章靜波. 《動物細胞培養——基本技術指南》(第五版)評介[J]. 基礎醫學與臨床, 2008(7):746-746.

[4] BARAHONA H H, HANSON R P. Plaque enhancement of Newcastle disease virus (lentogenic strains) by magnesium and diethylaminoethyl dextran[J]. Avian Diseases, 1968, 12(1):151.

[5] SCHLOER G, HANSON R P. Plaque morphology of Newcastle disease virus as influenced by cell type and environmental factors[J]. American Journal of Veterinary Research, 1968, 29(29):883-895.

[6] 王友令, 楊金興, 袁小遠,等. 新城疫GM2分離株蝕斑克隆純化及毒力測定[J]. 浙江農業學報, 2009, 21(6):565-568.

[7] 梁榮, 曹殿軍, 閻麗輝,等. 新城疫病毒分離株的蝕斑純化及影響蝕斑形成的主要因素[J]. 中國獸醫學報, 2003, 23(6):533-535.

2017-09-29

山東省農業科學院院青年科研基金(2014QNM15；2015YQN61；2016YQN56)；山東省自然科學基金(ZR2015CM009)。

張玉霞(1981—)，女，山東聊城人，助理研究員，碩士，主要從事禽病防治研究工作，Email: zyx1981_2007@163.com。

文獻著錄格式：張玉霞，袁小遠，孟凱，等. 新城疫病毒在雞胚成纖維細胞中的培養及純化[J].浙江農業科學，2017，58(12)：2265-2267.

10.16178/j.issn.0528-9017.20171257

S858.32

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0528-9017(2017)12-2265-03

萬 晶)