結腸癌血清microRNA表達譜的檢測及臨床應用價值*

王亞南，陳昭華，陳衛(wèi)昌

[1.蘇州大學附屬第一醫(yī)院，江蘇 蘇州 215006；2.蘇州市立醫(yī)院(南京醫(yī)科大學附屬蘇州醫(yī)院)，江蘇 蘇州 215002]

臨床研究·論著

結腸癌血清microRNA表達譜的檢測及臨床應用價值*

王亞南1，陳昭華2，陳衛(wèi)昌1

[1.蘇州大學附屬第一醫(yī)院，江蘇 蘇州 215006；2.蘇州市立醫(yī)院(南京醫(yī)科大學附屬蘇州醫(yī)院)，江蘇 蘇州 215002]

目的找尋潛在的新型的結腸癌血清microRNA（miRNA）表達譜，探討其臨床應用價值。方法miRNA微陣列芯片技術檢測結腸癌患者和正常人血清中miRNA表達的差異，并對有差異表達的miRNA在60例結腸癌患者血清和60例正常對照組血清中的表達進行實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）驗證。結果①芯片雜交結果中共有87種miRNAs在結腸癌患者血清和正常人血清標本中有差異表達，其中上調(diào)表達有39個，下調(diào)表達有48個。②qRT-PCR對miRNAs進行驗證，其中miR-31、miR-141、miR-224-3p、miR-576-5p和miR-4669這5個miR分子在結腸癌癥患者中的表達相對于正常對照組差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。③miR-31、miR-141、miR-224-3p、miR-576-5p和miR-4669這5個miR分子組成的miR-表達譜診斷結腸癌的效率較高（ROC曲線下面積為0.992）。結論臨床檢測結腸癌患者miR-31、miR-141、miR-224-3p、miR-576-5p和miR-4669循環(huán)分子標志物表達譜有助于診斷結腸癌，有望成為結腸癌患者臨床診療評估的重要指標。

結腸癌；血清microRNA；miRNA

結腸癌（colon cancer）的發(fā)生發(fā)展受多種因素的影響，是個多基因相關、多步驟的復雜過程。microRNA（miRNA）是一種長度為19～24個核苷酸，進化上高度保守的內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA，廣泛存在于動植物中。自1993年LEE等[1]在秀麗隱桿線蟲研究中發(fā)現(xiàn)了第一個miRNA-let4以來，截至2011年miRbase已收錄140個物種的15 000條miRNAs基因位點和17 000條不同的miRNAs序列[2]。目前有關研究[3-6]表明，miRNA的異常表達與結腸癌的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系。本技術利用miRNA微陣列芯片技術檢測結腸癌患者血清和正常人血清中miRNA表達的差異，并對有差異表達的miRNA進行實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）驗證，以找尋潛在的新型的結腸癌血清miRNA表達譜。

1 資料與方法

1.1 研究對象

芯片篩選miRANs標本來源，收集蘇州市立醫(yī)院住院的結腸癌患者血清樣本3例，其中，男性1例，女性2例，且其均未接受任何手術治療、放療或者化療，但均經(jīng)病理學檢查確診。組織病理類型的判斷參照WHO病理分期。3例健康對照血清來自醫(yī)院體檢者。收集蘇州市立醫(yī)院住院的結腸癌患者血清樣本60例，其中，男性30例，女性30例，且其均未接受任何手術治療、放療或者化療，但均經(jīng)病理學檢查確診。組織病理類型的判斷參照WHO病理分期。60例健康對照血清來自醫(yī)院體檢者。具體資料見表1。

1.2 實驗方法

1.2.1 血清標本處理 在結直腸癌患者術前、結腸息肉患者術前和正常人體檢時用一次性真空采血管采集空腹靜脈血5 ml，3 000 r/min，離心5 min，分離血清，取1 ml血清離心后于-80℃保存。

1.2.2 miRNA芯片檢測 3例結腸癌患者血清和3例正常人血清標本送至中國科學院蘇州納米技術與納米仿生研究所進行miRNA UniTag?微陣列芯片（無標記miRNA芯片分析方法）檢測[7]。結果經(jīng)過數(shù)據(jù)分析，根據(jù)改變倍數(shù)≥1.5且P＜0.05篩選與正常人血清相比在結腸癌患者中有差異表達的miRNA。

表1 結腸癌患者臨床資料

1.2.3qRT-PCR檢測miRNA的表達 血清RNA抽提，吸取血清250μl與Trizol 750μl于2 ml離心管中，充分震蕩混勻。按說明書操作進行RNA提取。紫外分光光度儀測定總RNA的吸光度（A260/280 nm）比值，取比值在1.8～2.2的標本用于后續(xù)試驗。miRNA3'末端加Poly（A）處理及逆轉錄反應按照miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒說明書（天根公司）操作進行。qRT-PCR按照miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒說明書（天根公司）操作。總反應體系為20μl，包括2×miRcute miRNA Premix（含SYBR、ROX）10μl，10μmol/L正向、反向引物各0.4μl，miRNA 第一鏈 cDNA 2μl，50×ROX 參比染料1.6μl，ddH2O 5.6μl。循環(huán)參數(shù) ：94℃預變性 2 min，94℃ 20 s，60℃ 34 s，共43個循環(huán)。以miR-16作為內(nèi)參照[8]，對目標基因進行歸一化處理，確保以相等數(shù)量的樣品比較目標基因的量。實驗設3個復孔。結果用2－△△Ct法[9]計算。取10μl qRT-PCR擴增產(chǎn)物，用30 g/L瓊脂糖凝膠電泳，結果用百瑞凝膠成像儀觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。采用單樣本Kolmogorov-Smirnov檢驗法對數(shù)據(jù)進行正態(tài)分布檢驗，因數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，計量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)間距，組間數(shù)據(jù)比較采用Wilcoxon檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。以手術切除的結腸癌組織病理報告為金標準，繪制血清miRNAs診斷結腸癌的ROC曲線，計算ROC曲線下面積及漸進95%可信區(qū)間。

2 結果

2.1 結腸癌患者血清中miRNA的芯片表達譜

芯片雜交結果經(jīng)過數(shù)據(jù)分析，根據(jù)改變倍數(shù)≥1.5且P＜0.05篩選與正常人血清相比在結腸癌患者中有差異表達的miRNA。共有87種miRNA在結腸癌患者血清和正常人血清標本中差異有統(tǒng)計學意義，其中上調(diào)表達有39個，下調(diào)表達有48個。差異表達的87種miRNA的熱圖結果見圖1、表2。

2.2 qRT-PCR對miRNAs進行驗證

通過查閱文獻，在芯片篩選出的87種差異表達的miRNA中有12種與結腸癌的細胞分化、轉移等相關[10]。用qRT-PCR對這12種miRNA進行驗證。其中 miR-31、miR-141、miR-224-3p、miR-576-5p和miR-4669這5個miR分子在結腸癌癥患者中的表達相對于正常對照組差異有統(tǒng)計學意義。結果見圖2、表3。

2.3 ROC曲線分析

以手術切除結腸癌組織的病理報告為金標準，繪制 miR-31、miR-141、miR-224-3p、miR-576-5p和miR-4669及由這5個miR分子組成的miR-表達譜在診斷結腸癌中的ROC曲線。見圖3、表4。

圖1 結腸癌患者和正常人血清標本miRNA芯片結果熱圖

表2 結腸癌患者血清中差異表達的miRNAs

圖2 miRNAs在結腸癌組和正常對照組血清中的表達

表3 miRNAs在結腸癌組和正常對照組血清中的表達

圖3 miRNAs診斷結腸癌ROC曲線

表4 miRNAs診斷結腸癌ROC曲線下面積及漸進95%可信區(qū)間

3 討論

結腸癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一。結腸癌發(fā)展過程主要涉及增生、腺瘤和癌變各階段，是一種多步驟、多階段、多基因參與的疾病。近年來，miRNA在結腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用成為人們研究的熱點。目前研究表明，miRNA具有癌基因和抑癌基因的作用。miRNA微陳列芯片憑借其高通量，快速檢測miRNA表達水平的優(yōu)點，成為了研究腫瘤發(fā)病機制，早期診斷，預后判斷的新方法。

本技術采用的UniTag?微陳列芯片是中國科學院蘇州納米技術與納米仿生研究所開發(fā)的非標記miRNA芯片檢測平臺（涵蓋2 154個全譜miRNA，version 19.0），該平臺“基于堆積雜交的通用標簽檢測方法”可以區(qū)分只有1個堿基差異的miRNA家族成員，尤其是可以有效排除非活性pri-miRNA與premiRNA前體的交叉雜交信號[7]。芯片篩選結果顯示共有87種miRNA在結腸癌患者血清和正常人血清標本中有差異表達，其中上調(diào)表達有39個，下調(diào)表達有48個，差異均在1.5倍以上且差異具有統(tǒng)計學意義。通過查閱文獻，在芯片篩選出的87種差異表達的miRNA中有12種與結腸癌的細胞分化、轉移等相關[10]。用qRT-PCR對這12種miRNA進行驗證。其中 miR-31、miR-141、miR-224-3p、miR-576-5p和miR-4669這5個miR分子在結腸癌癥患者中的表達相對于正常對照組差異具有統(tǒng)計學意義。

隨著分子生物技術的發(fā)展，與結腸癌有關的miRNAs陸續(xù)被人們發(fā)現(xiàn)。近年來有報道m(xù)iR-31與結腸癌有著密切的關系[11-12]。YANG等[13]發(fā)現(xiàn)miR-31在結腸癌組織中高表達，發(fā)生淋巴結轉移的結腸癌組織中miR-31的表達量高于未發(fā)生淋巴結轉移的結腸癌組織。血液標本獲取方便，對血清中miRNA進行檢測從而診斷結腸癌及判斷預后更適于臨床的應用，可是目前有關miR-31在結腸癌血清中的報道并不多見。血清中miR-31表達量的增加提示miR-31可以作為潛在的腫瘤標記物，以miR-31為靶點的治療將可能成為治療結腸癌的另一重要手段。

miR-141屬于miRNAs進化保守家族的一員，是具有上皮組織細胞特異性的微小RNA。miR-141作為miR200家族的成員之一，在結直腸癌、乳腺癌和前列腺癌中表達增高。目前對于結腸癌中miR-141表達的研究多見于結腸癌癥組織和結腸癌細胞株，對于結腸癌血清中miR-141的報道很少[14]。檢測結果提示miR-141在結腸癌患者血清中高表達。以手術切除結腸部位癌癥組織的病理報告為金標準，血清miR-141診斷結腸癌的ROC曲線下面積為0.933，具有較好的診斷效能。

OLARU等[15]研究miRNA在正常→炎性腸病→結腸癌過程中的作用，發(fā)現(xiàn)miR-224在炎性腸病發(fā)展的各個階段都表達上調(diào)，而且結腸癌中miR-224的表達水平高于正常黏膜和炎性腸病。進一步研究miR-224對結腸癌細胞生物學行為的影響，結果顯示miR-224在細胞周期的調(diào)控中發(fā)揮了重要作用，其加快了G1期→S期的進程，并且發(fā)現(xiàn)這種調(diào)控作用是通過影響細胞周期調(diào)控因子p21實現(xiàn)的。在本文的芯片篩查結果中，miR-224-3p在結腸癌血清中表達倍數(shù)是正常人血清的5.4倍。后經(jīng)過Real-time PCR驗證，與芯片結果一致。

BALDEóN等[16]發(fā)現(xiàn)，miR-576-5p在2型糖尿病患者的單核細胞中的表達水平升高。同時，他們還發(fā)現(xiàn)miR-576-5p與年齡有明顯的聯(lián)系，而miR-34c-5p并沒有。miR-576-5p目前在癌癥方面的研究較少。

朱桂璐等[17]對人乳腺癌BT474細胞及BT474/HER-2 siRNA細胞miRNAs表達譜結果分析，以BT474細胞為對照組，miR-4669在BT474/HER-2 siRNA細胞中表達下調(diào)，提示miR-4669在乳腺癌病情進展中可能與HER-2相關。目前miR-4669在結腸癌中的研究也很少。隨著循環(huán)miRNA研究的深入，關于miR-576-3p，miR-4669在癌癥方面的報道也會日益增多。

本研究分析了miR-31、miR-141、miR-224-3p、miR-576-5p和miR-4669新型miRNA循環(huán)分子標志物表達譜在結腸癌中的表達，5個miRNA聯(lián)合起來組成的miRNA循環(huán)分子標記物表達譜在診斷結腸癌方面比單個miRNA分子的診斷效能更高。miRNA循環(huán)分子標志物表達譜有望成為應用于結腸癌患者臨床診治評估的重要指標。將結腸癌檢查的不適度減至最輕，并提高檢測的敏感性和特異性，為實現(xiàn)結腸癌的早期診斷，預后判斷和延長結腸癌患者的生存時間，提高其生存質(zhì)量。

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Detection of serum microRNA pro fi le in colon cancer and its clinical application value*

Ya-nan Wang1, Zhao-hua Chen2, Wei-chang Chen1
[1. The First Aff i liated Hospital of Soochow University, Suzhou, Jiangsu 215006, China;2. Suzhou Municipal Hospital (Suzhou Hospital Aff i liated to Nanjing Medical University), Suzhou, Jiangsu 215002, China]

ObjectiveTo explore the potential novel serum microRNA (miRNA) pro fi le in colon cancer and discuss its clinical application value.MethodsThe difference of serum miRNA expression between colon cancer patients and healthy people was detected by miRNA microarray chip technology. The differential expression of miRNAs in serum of 60 cases of colon cancer and 60 normal people were validated by qRT-PCR.ResultsA total of 87 miRNAs were differentially expressed in the serum of the colon cancer patients compared to the normal people, among which 39 miRNAs were upregulated and 48 miRNAs were down-regulated. miR-31, miR-141, miR-224-3p, miR-576-5p and miR-4669 expressions in the colon cancer patients were signi fi cantly different from those in the normal control group (P＜ 0.05). MicroRNA pro fi le (including miR-31, miR-141, miR-224-3p,miR-576-5p and miR-4669) has a higher efficiency in diagnosis of colon cancer (area under the ROC curve was 0.992).ConclusionsClinical detection of expression pro fi le of circulating molecular markers miR-31, miR-141,miR-224-3p, miR-576-5p and miR-4669 in colon cancer patients is useful for the diagnosis of colon cancer. It is expected to be an important index for evaluation of clinical diagnosis and treatment in patients with colon cancer.

colon cancer; serum microRNA; expression pro fi le

10.3969/j.issn.1005-8982.2018.01.008

1005-8982（2018）01-0037-07

2017-02-17

蘇州市“科教興衛(wèi)”青年科技項目（No：KJXW2014017）

陳衛(wèi)昌，E-mail：weichangchen@126.com；Tel：0512-67781310

R735.3

A

（張西倩 編輯）