雙孢蘑菇培養料隧道發酵過程中胞外降解酶活性的變化

朱燕華，王 倩，宋曉霞，張津京，李正鵬，陳 輝，黃建春

（上海市農業科學院食用菌研究所，農業部南方食用菌資源利用重點實驗室，國家食用菌工程技術研究中心，國家食用菌加工技術研發分中心，上海市農業遺傳育種重點開放實驗室，上海 201403）

雙孢蘑菇培養料隧道發酵過程中胞外降解酶活性的變化

朱燕華，王 倩，宋曉霞，張津京，李正鵬，陳 輝，黃建春*

（上海市農業科學院食用菌研究所，農業部南方食用菌資源利用重點實驗室，國家食用菌工程技術研究中心，國家食用菌加工技術研發分中心，上海市農業遺傳育種重點開放實驗室，上海 201403）

研究了雙孢蘑菇培養料隧道式發酵各階段主要降解酶活性的變化情況。結果表明：各降解酶的酶活性呈現不同的變化規律。纖維素降解酶分別在不同發酵階段起作用，Cx酶活力在2次轉倉時達到峰值，而C1酶與BG酶的酶活力分別在二次料與一次料中最高。半纖維素降解酶中的木聚糖酶活力呈先上升后下降的變化趨勢，在2次轉倉時酶活力最高，而木糖苷酶的活力一直較低。木質素降解酶（Lac、MnP與LiP）的活力變化趨勢一致，均呈先上升后下降，再上升然后再下降的變化趨勢，在2次轉倉時各酶活力達到峰值。蛋白酶活力在1次轉倉時最高，此后開始下降，在二次料中再次升高。淀粉酶活力僅在培養料開始發酵的時期較高，此后的酶活力一直較低。培養料中的木質素在1次轉倉階段降解最快，而纖維素和半纖維素降解最快的時期是在2次轉倉階段。

雙孢蘑菇；培養料；發酵；酶活力

雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）是世界上栽培與消費最為廣泛的食用菌［1］。栽培雙孢蘑菇的原材料經過堆制后，形成有利于雙孢蘑菇菌絲生長，而不利于其他雜菌生長的具有“選擇性”的培養料。培養料的質量是影響雙孢蘑菇產量與質量的關鍵因素［2］，而堆肥中的微生物在培養料發酵過程中起著至關重要的作用［3］。雙孢蘑菇堆肥過程中的微生物群落種類與數量不斷演替，微生物活動時產生的胞外酶種類與活力大小也隨之不斷變化，促進堆肥各階段培養料中的物質轉化利用，從而形成了可促進雙孢蘑菇菌絲生長的具有“選擇性”的營養源［4］。目前對于不同雙孢蘑菇栽培的培養料配方方面的研究較多［5］，而對雙孢蘑菇隧道式發酵過程中的微生物群落與功能、微生物的降解酶系變化規律方面的研究較少［6］。國內企業雙孢蘑菇堆肥生產過程中仍主要憑借生產技術人員的經驗來主觀判斷，導致目前我國的雙孢蘑菇工廠化生產企業在堆肥的生產過程中，常出現培養料堆制過生或過熟、二次料氨氣無法排盡抑制雙孢蘑菇菌絲生長、堆肥的“選擇性”差致使栽培過程中雜菌滋生，大面積減產等問題，引發重大的經濟損失。本研究對工廠化隧道式發酵的雙孢蘑菇培養料發酵過程中的主要物質降解酶活性進行測定，分析發酵各階段的物質降解轉化特點，以期為進一步研究微生物群落在雙孢蘑菇培養料發酵中的功能及合理制定雙孢蘑菇堆肥技術提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

雙孢蘑菇（A.bisporus）A15菌種，由美國Sylvan公司提供。

1.2 試驗材料

堆肥配方為：稻草 23 t、麥草 15 t、棉籽殼 2 t、菜籽餅 2 t、石膏 2.5 t、碳酸鈣 1 t。

1.3 培養料發酵

試驗地點為上海市農業科學院金山雙孢蘑菇種植基地。雙孢蘑菇的培養料發酵采用二次發酵工藝。全麥草配方中的麥草預濕后與雞糞、石膏等均勻混合后，在一次發酵槽中進行發酵。60%稻草配方中的麥草提前2 d進行預濕，然后再與稻草、雞糞、石膏、棉籽餅等均勻混合。此后每隔2—3 d轉倉一次，轉倉3—4次后，完成一次發酵，持續時間約14 d左右。將一次料運至二次發酵隧道中，進行密閉式發酵，通過調節通風量控制培養料的溫度，依次經過均溫、巴氏消毒、空氣調節及冷卻階段，測定氨氣濃度低于0.005‰時，即可降溫完成二次發酵過程，持續時間約7 d左右。二次料運至菇房中，播撒雙孢蘑菇菌種，播種量為培養料干重的0.7%，采用上料機將培養料放于床架上進行發菌、出菇等栽培管理。

1.4 取樣方法

取樣階段為：進倉、1次轉倉、2次轉倉、3次轉倉、4次轉倉、一次料、二次料共7個取樣時期。

取樣時，將發酵隧道中的樣品分為3段取樣，即隧道前中后3個位置。每個位置間隔距離約5 m。在每個取樣位置的剖面，按高度分為上（頂部往下10—20 cm）、中、下（地面以上10—20 cm）3個部分，五點梅花形取樣，每個點取樣100 g，將每個剖面的5個樣品混勻后，采用四分法取樣，每個取樣時期的培養料樣品設3個重復。

1.5 測定方法

粗酶液提取：參照楊新美［7］的方法，從料面下2—3 cm處均勻取樣5 g，加入25 mL水，25℃搖床浸取1 h，轉速為150 r/min，然后4 000 r/min、5℃離心10 min，取上清液（或用四層紗布過濾，過濾液即為粗酶液），立即測定或于-30℃冰箱中保存待測。

纖維素酶活性測定：纖維素酶是一種復合酶系，由外切葡聚糖纖維二糖水解酶（C1酶）、內切葡聚糖酶（Cx酶）和β-葡聚糖苷酶（BG）組成，Cx酶、BG酶、C1酶活性的測定采用DNS法［8］。Cx酶與BG酶活力單位為1 mL酶液1 h產生1μmol葡萄糖為1個酶活力單位（U），C1酶活力單位為1 mL酶液24 h產生1μmol葡萄糖為1個酶活力單位（U）。

半纖維素酶活性測定：半纖維素降解酶主要為內切木聚糖酶與β-木糖苷酶。木聚糖酶與β-木糖苷酶活性的測定分別參照趙超等［8］與Cai等［9］。半纖維素的酶活力單位為1 mL酶液1 h產生1μmol葡萄糖為 1個酶活力單位（U）［8］。

木質素酶活性測定：木質素降解酶主要包含3個酶系：漆酶（Lac）、錳過氧化物酶（MnP）和木質素過氧化物酶（LiP），木質素降解酶活性的測定方法參照 Buswell等［10］。Lac酶活力單位（U）＝（A×106）/（∑420×d），其中 A＝60 s內吸收值的增加量，d＝光路（cm），比色皿的直徑；消光系數∑420＝3.6×104/（mol·cm）［11］。MnP酶活力單位（U）＝（A×106）/（∑240×d），其中 A＝60 s內吸收值的增加量，d＝光路（cm）；消光系數∑240＝8.1×103/（mol·cm）［12］。LiP酶活力單位（U）為1 min內在310 nm處引起吸光度值變化0.1所需的酶量［13］。

蛋白酶活力測定：參照倪新江等［14］的方法，蛋白酶活力單位（U）為每克干培養物30 min內改變0.1個光密度值。淀粉酶活力測定：參照王玉萬等［15］，淀粉酶活力單位（U）為每克干物質30 min內反應生產1 mg葡萄糖為1個酶活力單位。

2 結果與分析

2.1 培養料發酵過程中纖維素酶活性的變化

Cx酶作用于纖維素分子內部的非結晶區，隨機水解β-1，4糖苷鍵，產生大量有非還原端的小分子纖維素。在培養料發酵過程中，堆肥中的Cx酶活力呈先上升后下降的變化趨勢，在2次轉倉時酶活力達到高峰，為12.4 U/g，此后開始下降。C1酶主要作用于纖維素線狀分子的末端，水解β-1，4糖苷鍵，每次切下一個纖維二糖分子。C1酶活力在一次發酵過程中普遍較低，在二次料中的C1酶活力達到峰值，為8.24 U/g；BG酶的作用主要為將纖維二糖水解成葡萄糖分子，BG酶活力呈先上升后下降的趨勢，在一次發酵結束時達到峰值，二次料發酵結束后的BG酶活力再次降低。上述結果表明，纖維素降解復合酶系中的各種酶在雙孢蘑菇隧道式發酵不同階段發揮降解功能。

2.2 培養料發酵過程中半纖維素酶活性的變化

在雙孢蘑菇堆肥發酵過程中，降解半纖維素的主要酶為內切木聚糖酶，其作用主要為隨機切斷木聚糖骨架，產生木寡糖，降低聚合度。木聚糖酶活力呈先下降后上升，此后再下降的趨勢，木聚糖酶的峰值出現在2次轉倉開始時，酶活力達162.9 U/g，在3次轉倉時迅速下降至53.5 U/g。β-木糖苷酶的作用是將木寡糖和木二糖分解為木糖。相對于木聚糖酶，在雙孢蘑菇培養料發酵過程中的β-木糖苷酶活力較低，表明在雙孢蘑菇培養料發酵過程中，木聚糖酶在半纖維素降解中起主要作用。

圖1 培養料發酵過程中纖維素酶活性的變化Fig.1 Changes of cellulase activity during com post fermentation

圖2 培養料發酵過程中半纖維素酶活性的變化Fig.2 Changes of hem icellulose activity during compost fermentation

2.3 培養料發酵過程中木質素酶活性的變化

培養料發酵過程中的木質素降解復合酶系呈類似的變化趨勢，Lac、MnP與LiP這3種酶的活力在剛開始發酵時均逐漸上升，在第2次轉倉開始時達到峰值，此時酶活力最高的為Lac，其次為MnP，LiP的酶活力最低。第3次轉倉時，這3種木質素降解酶的活力均開始下降，在一次發酵結束時這3種酶的活力再次升高，二次發酵結束后，酶活力均再次下降。

2.4 培養料發酵過程中蛋白酶與淀粉酶活性的變化

雙孢蘑菇培養料中富含蛋白質，在發酵過程中蛋白酶活力也呈規律性變化，總體呈先上升后下降再上升的趨勢。蛋白酶活力的峰值出現在1次轉倉時，酶活力為17.5 U/g，表明此階段微生物大量轉化利用培養料中的氨基酸等小分子。此后，蛋白酶活力開始迅速下降，在一次發酵結束時最低，為0.6 U/g，但二次發酵結束時，堆肥中的蛋白酶活力又再次升高，達10.7 U/g，表明二次料中的微生物對蛋白質的降解利用較為旺盛。在進一次發酵倉時，培養料中的淀粉酶活力最高，此后逐漸下降，在2次轉倉時降至最低，酶活力為0.36 U/g，此后堆肥各階段的淀粉酶活力一直維持在較低的水平，表明在剛開始發酵時，微生物將易被利用的淀粉作為碳源，培養料中的淀粉等物質在2次轉倉前就已基本被微生物所利用消耗。

圖3 培養料發酵過程中木質素酶活性的變化Fig.3 Changes of ligninase activity during compost fermentation

圖4 培養料發酵過程中蛋白酶與淀粉酶活性的變化Fig.4 Changes of protease activity and amylase activity during compost fermentation

2.5 培養料發酵各階段培養料的木質纖維素降解率

雙孢蘑菇培養料中的木質素在二次發酵結束時的降解率為27.0%，其中在1次轉倉階段降解速率最快，木質素降解率約占整個發酵階段降解率的42.2%。培養料中纖維素與半纖維素在二次發酵結束時的降解率分別為57.9%與59.8%，其中在2次轉倉階段的降解速率最快，降解率分別為38.4%與39.0%。

圖5 培養料發酵過程中木質纖維素降解率的變化Fig.5 Changes of lignocellulose degradation rate during com post fermentation

3 討論

本研究表明，該批次的培養料栽培雙孢蘑菇的三潮菇總產量為25.4 kg/m2，表明培養料的質量較好。在雙孢蘑菇培養料隧道式發酵過程中，培養料中主要物質降解酶系的酶活力呈現不同的變化規律，在2次轉倉開始時的木質素降解酶（Lac、MnP與LiP）、纖維素降解酶（Cx酶）及半纖維素降解酶（木聚糖酶）的酶活力均達到峰值，表明在堆肥過程中2次轉倉開始時的微生物對培養料中主要成分的降解轉化能力最強。此外，一次發酵料中的3種木質素降解酶與BG酶活力也較高。二次發酵料中可能由于存在大量的細菌殘體蛋白［16］，有利于其他微生物進行生長利用，因而二次料的蛋白酶活力也較高。李曉博等［6］采用傳統方法進行雙孢蘑菇培養料發酵過程中酶活性變化的研究表明，半纖維素酶活力在第2次翻堆時最高，纖維素酶活力在第4次翻堆時最高，而漆酶活力在第3次翻堆時最高，酶活力峰值的出現時間均低于本研究中利用隧道進行培養料發酵，這可能是由于隧道式發酵環境更有利于微生物群落快速繁殖與演替，從而加速了發酵進程。侯曉偉等［17］研究表明，利用大麥秸稈作為原材料進行雙孢蘑菇培養料發酵，培養料中的纖維素和半纖維素降解最快的時期在第2次翻堆后，這與本研究結果一致。在雙孢蘑菇培養料發酵過程中，纖維素降解酶系中的各降解酶在培養料發酵過程中呈現不同的變化規律，各自在特定發酵階段發揮降解作用，培養料中纖維素降解最快的時期Cx酶活力也處于峰值，表明Cx酶可能在纖維素的降解中起主導作用。木聚糖酶是培養料中半纖維素降解的主要酶。木質素降解酶系中的各種酶變化規律一致，這3種酶在木質素降解過程中存在較好的協同關系，共同作用從而完成各階段的木質素降解。根據本研究結果，結合各種降解酶活性的變化規律，在雙孢蘑菇培養料隧道式發酵過程中應使培養料溫度盡快升高，從而使木質纖維素的相關降解酶活性在較短時間內達到峰值，這對于縮短培養料發酵時間，減少培養料中的物質能量損耗具有重要作用。培養料發酵各階段酶活性變化特性的研究也為進一步了解雙孢蘑菇培養料隧道式發酵中微生物對物質的降解轉化規律及提高雙孢蘑菇培養料發酵的質量等提供參考。

［1］BERENDSEN R，KALKHOCE S，LUGONES L，et al.Effects of themushroom-volatile 1-octen-3-ol on dry bubble disease［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2013，97（12）：5535-5543.

［2］KARIAGA M.Important factors in composting for production of high yields in button mushrooms and Agaricus bitorquis（Quel）Saccardo［J］.African Crop Science Conference Proceedings，2005，7：1273-1277.

［3］郭亞萍，張國慶，陳青君，等.雙孢蘑菇堆肥過程中細菌群落結構分析［J］.應用與環境生物學報，2014，20（5）：832-839.

［4］LIYAMA K，STONE B，Macauley B J.Compositional changes in compost during composting and growth of Agaricus bisporus［J］.Appl Environ Microbiol，1994，60（5）：1538-1546.

［5］陳茜，王建立，郭亞萍，等.不同培養料配方對雙孢蘑菇產量的影響［J］.中國農學通報，2014，30（4）：185-189.

［6］李曉博，李曉，李玉.雙孢蘑菇生產中木質素、纖維素和半纖維素的降解及利用研究［J］.食用菌，2009（2）：6-9.

［7］楊新美.食用菌研究法［M］.北京：中國農業出版社，1998.

［8］趙超，高兆銀，劉美珍.不同配方蔗渣培養基對平菇纖維素酶活性和產量的影響［J］.浙江農業科學，2010（1）：31-34.

［9］CAIY，BUSWELL JA，CHANG S.Cellulases and hemicellulases of Voluarielka volvacea and the effect of Tween 80 on enzyme production［J］.Mycological Research，1994，98：1019-1024.

［10］BUSWELL J，CAIY，CHANG S，et al.Lignocellulolytic enzyme profiles of ediblemushroom fungi［J］.World JMicrobiol Biotechnol，1996，12（5）：537-542.

［11］ISIKHUEMHEN O，MIKIASHVILIN，KELKAR V.Application of solid waste from anaerobic digestion of poultry litter in Agrocybe aegerita cultivation：mushroom production，lignocellulolytic enzymes activity and substrate utilization［J］.Biodegradation，2009，20：351-361.

［12］AITKEN M，IRVINE R.Characterization of reactions catalyzed by manganese peroxidase from Phanerochaefe chysosporium［J］.Archives of Biochemistry and Biophysics，1990，276：405-414.

［13］ARORA D，Gill R.Comparison of two assay procedures for lignin peroxidase［J］.Enzyme and Microbal Technology，2001，28：602-605.

［14］倪新江，丁立孝，潘迎捷，等.姬松茸在兩種培養基上生長期間九種胞外酶活性變化［J］.菌物系統，2001，20（2）：222-227.

［15］王玉萬，王云.構菌栽培過程中對木質纖維素的降解的和幾種多糖分解酶活性的變化［J］.微生物學通報，1989，16（3）：137-140.

［16］SMITH J.Factorsaffecting the selectivity of composts suitable for the cultivation of Agaricus species［D］.England：University of London，1994.

［17］侯曉偉，王曉巍，陳年來，等.雙孢蘑菇培養料發酵微生物變化對其理化性質的影響研究［J］.中國農學通報，2014，30（25）：111-115.

Changes of extracellular degrading enzyme activity during the tunnel fermentation of Agaricus bisporus com post

ZHU Yan-hua，WANG Qian，SONG Xiao-xia，ZHANG Jin-jing，LIZheng-peng，CHEN Hui，HUANG Jian-chun*
（Institute of Edible Fungi，Shanghai Academy of Agricultural Sciences；Key Laboratory of Edible Fungi Resources and Utilization（South），Ministry of Agriculture，P.R.China；National Engineering Research Center of Edible Fungi；National R＆D Center for Edible Fungi Processing；Key Laboratory of Agricultural Genetics and Breeding of Shanghai，Shanghai201403，China）

The changes ofmain degrading enzyme activities in different stages of tunnel culture of Agaricus bisporus compost were studied.The results showed that the activities of different degrading enzymes showed different change rules.Cellulose degrading enzymes acted at different fermentation stages，and Cx enzyme activity reached the peak at the second turn，while the activities of C1 and BG enzymeswere the highest in the secondary materials and primarymaterials respectively.Hemicellulose degrading enzymes include xylanase and xylosidase.Xylanase activity increased firstand then decreased，and reached the highestat the second turn，while the activity of xylosidase was always low.The change trend of lignin degrading enzymes（Lac，MnP and LiP）were the same，and they all increased first，then decreased，then increased，and then decreased，and reached the peak at the second turn.Protease activity was the highest at the first turn，then decreased，and increased again in the secondarymaterials.Amylase activity was only higher at the beginning of fermentation，and then the enzyme activity was always low.Lignin in the culture medium degraded fastest at the first turn，while cellulose and hemicellulose degraded fastest at the second turn.

Agaricus bisporus；Culturematerial；Fermentation；Enzyme activity

2016-04-11

農業部公益性（農業）行業科研專項（201503137）；上海市科技興農推廣項目 ［滬農科推字（2014）第2-2號］；上海市科學技術委員會科研計劃項目（15391900200）

朱燕華（1982—），女，博士，助理研究員，主要從事雙孢蘑菇栽培與生理研究。E-mail：zhuyanhua＠saas.sh.cn，Tel：021-62200538

*通信作者，E-mail：jianmushroom＠163.com

S646

A

1000-3924（2017）06-006-05

閆其濤）