玉米中伏馬毒素產生菌的分離鑒定及其產毒條件的研究

郭文博，沈源源，楊俊花，范 楷，趙志輝，韓 錚

（上海市農業科學院農產品質量標準與檢測技術研究所，上海市設施園藝技術重點實驗室，上海市農產品質量安全評價技術服務平臺，上海農產品質量安全工程技術研究中心，上海 201403）

玉米中伏馬毒素產生菌的分離鑒定及其產毒條件的研究

郭文博，沈源源，楊俊花，范 楷，趙志輝，韓 錚*

（上海市農業科學院農產品質量標準與檢測技術研究所，上海市設施園藝技術重點實驗室，上海市農產品質量安全評價技術服務平臺，上海農產品質量安全工程技術研究中心，上海 201403）

從發霉的玉米中分離鑒定產生伏馬毒素B1（Fumonisin B1，FB1）和伏馬毒素B2（Fumonisin B2，FB2）的真菌菌株并對其產毒條件（培養基、溫度、時間、水分含量）進行考察，揭示伏馬毒素的發生規律。將發霉玉米的提取液接種至PDA培養基，利用平板劃線法分離獲得產毒菌株，通過形態學觀察和rDNA-ITS序列分析分別進行真菌形態學和種屬鑒定；將產毒菌株接種在不同培養基上并選擇不同條件（溫度、時間、水分含量）培養，利用高效液相色譜-串聯質譜法（HPLC-MS/MS）對不同培養條件下各種培養基中FB1、FB2進行定量檢測。BLAST結果表明，分離得到的菌株DNA序列與NCBI數據庫中登錄號為KC709665.1、KR020684.1和KR052812.1的擬輪生鐮孢菌（Fusarium verticillioides）序列同源性均為100%，證明分離得到的產毒菌株為F.verticillioides。接種試驗表明，F.verticillioides的最佳產毒條件為玉米培養基，40%水分含量，28℃黑暗條件下培養28 d，FB1、FB2產量分別達到821.08 mg/kg、339.50 mg/kg。本研究玉米中伏馬毒素產毒菌株主要為F.verticillioides，且伏馬毒素的產生與培養基、溫度、時間和水分含量等環境因素密切相關。

伏馬毒素；擬輪生鐮孢菌；分離；產毒條件；玉米

伏馬毒素主要是由擬輪生鐮孢菌（Fusarium verticillioides）、層生鐮孢菌（F.proliferatum）和硫色鐮孢菌（F.sulphureum）在一定溫度和濕度條件下產生的一組水溶性次級代謝產物［1-2］，主要污染玉米及其制品，在世界范圍內特別是玉米產區廣泛分布［3］。常見的伏馬毒素主要為伏馬毒素B1（Fumonisin B1，FB1）和伏馬毒素B2（Fumonisin B2，FB2），是一類由不同的多氫醇和丙三羧酸組成的結構類似的雙酯化合物，其結構與人和動物體內的神經鞘氨醇極為相似，在神經鞘脂代謝過程中可競爭性地結合神經鞘氨醇N-2酰基轉移酶，從而抑制神經鞘氨醇的生物合成、阻礙鞘脂類代謝，引發各種疾病［4］，如馬的大腦白質軟化癥（Equine leucoencephalomalacia，ELEM）［5］、豬肺水腫綜合征（Porcine pulmonary edema，PPE）［6］、嚙齒類動物的肝臟和腎臟損傷等［7］。此外，伏馬毒素還具有很強的細胞毒性［8］和免疫毒性［9］，與人類食道癌的發生密切相關［10-12］。

伏馬毒素的產生與鐮刀菌種屬及其生長的環境條件密切相關，不同種屬的鐮刀菌在不同的條件下產生伏馬毒素的種類和能力均存在差異［13-14］。其中，溫度、水分含量、培養時間、基質等是影響伏馬毒素產量的主要因素。目前，國內對伏馬毒素發生規律的報道主要集中在馬鈴薯葡萄糖培養基（PD）、馬鈴薯蔗糖培養基（PS）、察氏培養基（Czapek）和理查德培養基（Richard）等常規培養基。研究結果表明，在馬鈴薯葡萄糖培養基中F.verticillioides的最佳產毒條件為pH 9、12 h光暗交替、25℃、培養10 d［15］；在Richard培養基的最佳產毒條件為25℃、pH 5、培養10 d［16］。但對玉米、大米等實際高產毒培養基的產毒條件如溫度、水分含量等影響因素缺乏系統的考察，限制了伏馬毒素標準品的研制及動物毒理學的研究和發展。

本研究首先從發霉的玉米中分離鑒定獲得伏馬毒素的主要產毒菌株，將其分別接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）和馬鈴薯葡萄糖培養基（PD）、玉米和大米四種培養基質上，采用LC-MS/MS技術分析不同培養基、培養溫度、培養時間和水分含量下伏馬毒素的產生量，構建不同培養基中伏馬毒素的產生量與溫度、時間和水分含量的非線性回歸模型，旨在揭示伏馬毒素的發生規律，對防控伏馬毒素污染、保證農產品質量安全具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與培養基

優質玉米、大米、土豆，均購自上海某超市，發霉玉米（10份）收集于上海某農貿市場。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）和馬鈴薯葡萄糖培養基（PD）［17］。大米培養基：稱取50 g優質大米至250mL三角瓶，加入20 mL蒸餾水混勻，用透氣封口膜密封瓶口，浸泡過夜，121℃滅菌30min，冷卻后將大米搖散待用。玉米培養基：稱取50 g優質玉米至250 mL三角瓶，加入20 mL蒸餾水混勻，用透氣封口膜密封瓶口，浸泡過夜，121℃滅菌30 min，冷卻后將玉米搖散待用。

1.2 試劑與儀器

FB1、FB2標準品（德國Sigma公司）；葡萄糖、瓊脂（上海源葉生物科技有限公司）；甲醇、乙腈（色譜純，美國Merck公司）；甲酸（色譜純，中國Aladdin公司）。真菌基因組DNA小量制備試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒（美國AXYGEN公司）；Taq DNA聚合酶（上海桑尼生物科技有限公司）；DNA marker［Takara，寶生物工程（大連）有限公司］。

液相色譜-串聯質譜：TSQ Quant配 Surveyor液相操作系統（美國 Thermo Fisher Scientific公司）；Eppendorf 5804R離心機（德國Eppendorf公司）；Applied Biosystems 2720 PCR儀、Applied Biosystems 3730-XL測序儀（美國Applied Biosystems公司）；Tanon 2500凝膠成像系統（上海天能科技有限公司）；Thermo Scientific Heraguard ECO超凈臺（美國Thermo Fisher Scientific公司）；霉菌培養箱（上海精宏實驗設備有限公司）；SX-500高壓滅菌鍋（日本TOMY公司）。

1.3 方法

1.3.1 菌株分離方法

稱取10 g伏馬毒素含量超標的發霉玉米，加入100 mL無菌水震蕩提取30 min，分別取10-1、10-2、10-3的稀釋液200μL涂布于PDA培養基平板上，28℃培養，48 h后利用平板劃線法逐步分離得到單菌落，將分離得到的單一菌落接種于PDA培養基上28℃黑暗培養7 d，備用。

1.3.2 產毒菌株的分子生物學鑒定

對于大多數真核生物來說，核糖體內轉錄間隔區（ITS）序列分析被廣泛應用于真菌物種的分子鑒定以及屬內物種間或種內差異較明顯的菌群間的系統發育關系分析。本試驗利用特異性的引物進行PCR擴增，確定產毒菌的種類。引物由上海派森諾生物科技股份有限公司合成，序列如下：ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGC，ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC。PCR擴增反應體系包括：DNA（20 ng/μL）1.0μL，10×Buffer（含2.5×10-3mol/LMg2+）5μL，Taq聚合酶（5 U/μL）1.0μL，dNTP（1×10-5mol/L）1.0μL，ITS1引物（1×10-5mol/L）1.5μL，ITS4引物（1×10-5mol/L）1.5μL，ddH2O 39.0μL。PCR擴增程序：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個循環；最后72℃延伸7 min。反應完成后，PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，確認PCR擴增片段。PCR產物經膠回收后用ABI3730-XL測序儀進行堿基序列測定，將拼接后的序列與NCBI核酸數據庫進行比對，得到待測菌株的菌種信息。

1.3.3 培養條件與方法

將分離獲得的產毒菌株接種于PDA培養基，28℃黑暗條件下培養7 d后，備用。用無菌打孔器從PDA培養基上取直徑為0.5 cm的菌絲塊，分別將菌絲塊接種至PDA、PD、玉米、大米培養基中，每份接種3塊菌絲塊，用無菌透氣封口膜密封，搖勻，28℃黑暗條件下培養4周。接種第1周，每天振蕩三角瓶1次，使菌絲與培養基充分接觸，避免玉米、大米培養基凝結成塊，培養結束后，40℃烘干，待用。

1.3.4 產毒條件優化

①不同培養基：將分離獲得的產毒菌株分別接種于PDA、PD、玉米、大米培養基，28℃、40%水分含量條件下培養28 d，每7 d重復取樣3份；②培養時間：將分離獲得的產毒菌株接種于玉米培養基，28℃、40%水分含量條件下培養35 d，每7 d重復取樣3份；③培養溫度：將分離獲得的產毒菌株接種于玉米培養基，20℃、25℃、28℃、30℃、35℃，40%水分含量培養28 d，每7 d重復取樣3份；④水分含量：在250 mL的三角瓶中裝入50 g玉米，然后分別加入10 mL、15 mL、20 mL、25 mL、30 mL水，即調節水分含量為20%、30%、40%、50%、60%，接種分離得到的產毒菌株，28℃培養28 d，每7 d重復取樣3份。

1.3.5 樣品處理

液體培養基：PD培養液渦旋振蕩5 min，取2 mL于10 mL離心管中加入2.0 mL乙腈，渦旋混合1 min，超聲1 h，4 000 r/min離心10min，取上清液過0.22μm濾膜后用乙腈-水（50∶50，v/v）稀釋100倍后上機測定。

固體培養基：將3種固體培養基粉碎混勻后準確稱取（1.00±0.01）g樣品于10 mL離心管中，加入5.0 mL乙腈-水（50∶50，v/v）提取，渦旋混合1min，超聲1 h，4 000 r/min離心10min，取上清液過0.22μm濾膜后用乙腈-水（50∶50，v/v）稀釋104倍后上機測定。

1.3.6 LC-MS/MS檢測條件

Thermo C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，5μm）；流動相A為甲醇，流動相B為0.1%甲酸水；線性梯度洗脫程序：0 mim（40%A），1 min（60%A），7 min（100%A），8 min（100%A），8.2 min（40%A），9.0 min（40%A）；流速為300μL/min；進樣量5μL；柱溫30℃。

采用正離子模式的電噴霧（ESI+）離子源，多反應監測模式（MRM）采集；FB1和FB2的母離子、子離子、碰撞能量等參數見表1；噴霧電壓為3.5 kV；碎裂電壓為1.5 V；毛細管溫度為350℃；霧化氣壓力3 500 Pa；輔助氣壓 15 Pa；鞘氣壓 45 Pa。

表1 伏馬毒素B1、B2質譜條件參數Table 1 M ass spectrometry parameters for FB1 and FB2

2 結果與分析

2.1 伏馬毒素含量測定

本試驗利用HPLC-MS/MS技術，采用多反應監測模式（MRM），建立測定玉米培養基中FB1和FB2含量的分析方法。試驗結果表明：玉米培養基樣品中FB1和FB2在1—200μg/kg之間線性關系良好，相關系數（R2）均大于0.999，定量限為0.3μg/kg，檢出限為0.1μg/kg；采用空白基質加標的方法，考察方法的回收率和精密度，得到低、中、高濃度加標回收率為88.6%—95.3%，精密度（RSD%）范圍是2.9%—6.8%。通過方法學考察，表明采用的方法靈敏、準確、可靠，滿足本試驗中對PDA、PD、玉米和大米中FB1和FB2的準確定量。標準溶液和玉米產毒培養基中FB1、FB2色譜圖如圖1。

圖1 伏馬毒素B1、B2色譜圖Fig.1 Chromatograms of FB1 and FB2 in standard solution（A）and maizemedium（B）

2.2 伏馬毒素產生菌的鑒定

利用微生物稀釋分離法和平板劃線法，將分離得到的產伏馬毒素的菌株接種于PDA培養基，28℃黑暗條件下培養7 d，由圖2可見：菌落為棉絮狀平鋪PDA培養基中，氣生菌絲為白色，基內菌絲為淺粉色，培養基反面呈淡黃色；在顯微鏡下觀察到大型分生孢子呈鐮刀形，數量較少，而小型分生孢子呈橢圓形，數量較多且多為棒形、無分隔。根據《真菌鑒定手冊》《常見鐮孢霉鑒定手冊》《中國真菌志》等工具書，初步鑒定為鐮刀菌［18-20］。

提取菌株DNA后，用IST1和IST4引物進行PCR擴增，得到550 bp左右的目的條帶（圖2），對純化后的PCR產物進行序列測定后，與NCBI數據庫中已知菌株信息比對，結果表明：試驗菌株與數據庫中登錄號為KC709665.1、KR020684.1和KR052812.1的F.verticillioides序列同源性均為100%。最終，本試驗經過形態學鑒定和rDNA-ITS序列分析，共獲得8株產伏馬毒素的F.verticillioides，并利用Fum-1進行最佳產毒條件的優化。

圖2 分離菌株的形態特征及PCR鑒定結果Fig.2 Morphological characteristics and PCR identification of isolates

2.3 培養時間對F.verticillioides產毒量的影響

由圖3可見，F.verticillioides在不同培養基上產毒量隨時間的延長呈動態變化，本試驗將PDA、PD、玉米和大米培養基培養時間設為35 d。在0—7 d，PDA和PD培養基中FB1、FB2含量逐漸升高，在第14天達到最大；在0—28 d，玉米和大米培養基中FB1、FB2含量逐漸增加，在第28天達到最大。當培養基中伏馬毒素含量達到最大后，隨著培養時間的繼續增加，4種培養基中FB1、FB2含量均略微下降。

不同研究表明，F.verticillioides的產毒能力與培養基密切相關［15-16，21］。本試驗中4種培養基均能產生伏馬毒素，但產毒量存在明顯差異。PDA與PD培養基中FB1、FB2含量極低，大米培養基中FB1、FB2含量分別為598.03 mg/kg、284.01mg/kg，玉米培養基中FB1、FB2含量分別為821.08mg/kg、339.50mg/kg，均遠遠高于PDA與PD。

圖3 培養時間對擬輪生鐮孢菌產毒的影響Fig.3 Effect of incubation time on toxin-producing ability of F.verticillioides

2.4 培養溫度對F.verticillioides產毒量的影響

將接種F.verticillioides的玉米培養基分別在20℃、25℃、28℃、30℃、35℃，40%水分含量條件下培養28 d，結果見圖4。結果表明：當培養溫度低于28℃時，伏馬毒素產量隨溫度的增加而增加；當培養溫度高于28℃時，伏馬毒素產量隨溫度的增加而降低。本試驗中28℃條件下玉米中FB1和FB2含量最高，分別達到817.08 mg/kg、329.01 mg/kg。因此，本試驗最終選擇28℃作為最佳培養溫度。

2.5 水分含量對F.verticillioides產毒量的影響

將F.verticillioides分別接種在水分含量在20%、30%、40%、50%、60%的玉米培養基，28℃培養28 d，結果見圖5。結果表明：水分含量從20%到40%，FB1和FB2產量不斷增加，水分含量為40%時，伏馬毒素含量達到最大，分別為808.21 mg/kg、321.15 mg/kg，當水分含量超過40%時，伏馬毒素含量逐漸下降。因此，最終將培養基水分含量定為40%。

圖4 培養溫度對擬輪生鐮孢菌產毒的影響Fig.4 Effect of incubation tem perature on toxin-producing ability of F.verticillioides

圖5 水分含量對擬輪生鐮孢菌產毒的影響Fig.5 Effect of water content on toxin-producing ability of F.verticillioides

3 討論

F.verticillioides是一類世界性分布的真菌，它不僅可以存在于土壤及動植物體內，還可侵染多種重要經濟作物，引起苗枯、根腐、莖腐和穗腐等病害［22］，其生長產毒與地域環境、耕作制度、氣候條件等有關，不同國家和地區分布存在明顯差異。關于玉米致病菌群的研究表明，北美洲以F.verticillioides和禾谷鐮孢菌（F.graminearum）為優勢菌株［23］，南美洲則以 F.proliferatum為優勢菌菌［24］；我國北方玉米中，F.graminearum為主要致病菌，F.verticillioides較少［25］。本研究從發霉玉米中共分離得到14株鐮孢菌，經過形態學和分子生物學鑒定，伏馬毒素產生菌主要為F.verticillioides，占54%，與其他關于玉米中真菌污染的調查分析結果一致［22，26-27］，均表明F.verticillioides能夠引起玉米霉變并產生伏馬毒素的污染。

F.verticillioides產毒量與培養基種類、培養溫度、培養時間、水分含量等因素密切相關。本試驗結果表明F.verticillioides的最佳產毒條件為玉米培養基，40%水分含量，28℃黑暗條件下培養28 d。隨著培養時間的延長，四種培養基中伏馬毒素產量均呈先增加后下降趨勢，此結果與李俊霞等［16］研究結果一致，由此表明F.verticillioides產毒量與菌絲的旺盛生長期相關，隨著培養時間延長，菌絲逐漸老化，溶氧量降低，同時其他抑制性作用代謝產物增加，造成毒素總量下降。另外，伏馬毒素降解及本身作為碳源被F.verticillioides利用也可能是伏馬毒素含量下降的原因［28］。當培養溫度為20—28℃時，F.verticillioides生長迅速，伏馬毒素產量逐漸增加；當培養溫度高于30℃時，F.verticillioides生長變緩慢，產毒量逐漸降低，說明較高的培養溫度能夠抑制F.verticillioides產毒，與師雯等［29］研究結果一致。水分含量也是影響微生物生長的重要因素，當水分含量為20%時，由于培養基表面干化，F.verticillioides生長緩慢，造成培養基利用率不高，伏馬毒素產量較低；當培養基水分含量為40%，玉米培養基中菌絲生長迅速，伏馬毒素產量最高；而當水分含量大于40%時，培養基結塊成團，使培養基溶氧量不足，從而造成菌絲生長不良，不利于F.verticillioides產毒，伏馬毒素的產生量降低。

4 結論

伏馬毒素在世界范圍內廣泛分布，不僅嚴重影響農作物品質，還對人和動物健康造成潛在的危害。本研究在已有報道的基礎上［30-31］，從發霉玉米中分離鑒定產伏馬毒素的F.verticillioides，系統地研究了其在不同培養基、溫度、時間、水分含量條件下產生伏馬毒素的量，揭示了伏馬毒素的產生規律，對F.verticillioides和伏馬毒素污染防控具有重要意義。

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Isolation and identification of fumonisin-producing strains from maize and research on their toxin-producing conditions

GUOWen-bo，SHEN Yuan-yuan，YANG Jun-hua，FAN Kai，ZHAO Zhi-hui，HAN Zheng*
（Institute of Agro-Food Quality Standards and Testing Technology，Shanghai Key Laboratory of Protected Horticultural Technology，Shanghai Service Platform of Agro-Products Quality and Safety Evaluation Technology，Shanghai Engineering Research Center of Agro-Products Quality and Safety，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai201403，China）

To isolate and identify the fungi producing fumonisins B1 and B2（FB1 and FB1）from moldy maize and investigate the conditions（medium，temperature，incubation time and water content）for the fungi to produce fumonisins，the extract ofmoldy maize were inoculated on PDA medium，and the toxigenic strains were isolated by plate streak approach.The species of the strains were identified respectively by morphologic observation and rDNA-ITS analysis，then the strains were inoculated on different media and cultured under different temperatures，incubation times and water contents，and finally the FB1 and FB2 were quantitatively determined by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（HPLC-MS/MS）.The BLAST showed that the isolated strains and the Fusarium verticillioides KC709665.1，KR020684.1 and KR052812.1 in the NCBIwere 100%in DNA sequence homology，demonstrating the isolated strain to be F.verticillioides.The inoculation experiment showed that the optimal conditions for fumonisins production were 40%water content and maizemedium at28℃ in dark for 4 weeks，and the FB1 and FB2 yields could be up to 821.08 mg/kg and 339.50 mg/kg respectively.The fumonisin-producing strains in the testedmaizeweremainly F.verticillioides，and the fumonisins production was closely related to such environmental factors as culturemedium，temperature，time and water content.

Fumonisin；Fusarium verticillioides；Isolation；Toxin-producing conditions；Maize

Q93-331

A

1000-3924（2017）06-078-07

2016-09-08

上海市科技興農重點攻關項目［滬農科攻字（2015）第6-3-2號］

郭文博（1988—），男，碩士，研究實習員，研究方向：農產品質量安全。E-mail：guo1103bo＠126.com，Tel：021-67131637

*通信作者：韓錚（1983—），男，博士，研究員，研究方向：農產品質量安全。E-mail：hanzheng_ok＠163.com，Tel：021-37196975

程智強）