溫州地區(qū)地中海貧血基因突變類型分析

徐琦煜，周武，錢菁菁，周翠

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，浙江 溫州 325015）

·短 篇 論 著·

溫州地區(qū)地中海貧血基因突變類型分析

徐琦煜，周武，錢菁菁，周翠

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，浙江 溫州 325015）

目的：了解溫州地區(qū)地中海貧血（簡(jiǎn)稱地貧）基因突變類型和構(gòu)成比，為優(yōu)生優(yōu)育提供參考。方法：選取溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院和溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院門診及住院的疑似地貧患者991例，進(jìn)行地貧基因突變檢測(cè)，其中3種缺失型α-地貧采用跨越斷裂點(diǎn)PCR（GAP-PCR）法；3種α-地貧點(diǎn)突變和17種常見β-地貧突變采用反向點(diǎn)雜交（RDB）法。結(jié)果：991例疑似地貧患者中共檢出431例地貧患者，陽性率為43.49%。其中α-地貧155例，最常見的為--SEA/αα缺失（占α-地貧的67.10%）；檢出β-地貧276例，最常見為CD41-42突變（占β-地貧的35.87%）；同時(shí)檢出αβ復(fù)合型地貧基因7例。結(jié)論：溫州地區(qū)的地貧基因突變類型多且復(fù)雜，應(yīng)加強(qiáng)基因診斷，為地貧的遺傳咨詢和臨床診療提供參考。

α地中海貧血；β地中海貧血；突變類型；點(diǎn)突變

地中海貧血（thalassemia）簡(jiǎn)稱地貧，是由于血紅蛋白珠蛋白肽鏈合成障礙或速率降低、血紅蛋白產(chǎn)量減少所引起的一組遺傳性溶血性貧血。其中較為常見的有α-地貧和β-地貧，α-珠蛋白基因位于16號(hào)染色體短臂13區(qū)3帶，其缺失或點(diǎn)突變均可導(dǎo)致α-地貧，其中缺失型最多見；β-珠蛋白基因位于11號(hào)染色體短臂1區(qū)2帶，多由點(diǎn)突變引起β-地貧[1]。地貧是世界上最常見和發(fā)病率最高的，也是危害最嚴(yán)重的血紅蛋白病之一，我國(guó)廣西、廣東等地多見[2]。溫州位于浙江省東南部，隨著外來人口的增加，尤其是來自地貧高發(fā)率地區(qū)，將不可避免地提高本地區(qū)地貧的發(fā)生率。本研究對(duì)溫州地區(qū)991例疑似地貧患者的基因突變類型進(jìn)行研究，探討該地區(qū)地貧基因突變的類型及構(gòu)成比，為溫州地區(qū)開展地貧的遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷提供重要的參考依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2014年1月至2015年12月溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院和溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院門診及住院疑似地貧患者991例，年齡為2 d至75歲，其中男432例，女559例。入選標(biāo)準(zhǔn)：血常規(guī)平均紅細(xì)胞體積≤80 fL，平均紅細(xì)胞血紅蛋白＜27 pg，血樣間無親緣關(guān)系，性別和年齡均不限。基因型檢測(cè)試劑盒購于深圳亞能生物有限公司。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有檢測(cè)均獲得患者的知情同意。

1.2 方法

1.2.1 全血DNA的提取：用無菌EDTA抗凝管抽取靜脈血2 mL，采用DNA快速提取試劑盒提取DNA，操作步驟見試劑盒說明書。

1.2.2 缺失型α-地貧基因檢測(cè)：采用跨越斷裂點(diǎn)PCR法（GAP-PCR）檢測(cè)3種常見基因缺失（--SEA/αα、-α4.2/αα、-α3.7/αα）。PCR反應(yīng)體系：總體積25 μL，含PCR反應(yīng)液21 μL、DNA模板2 μL、純水2 μL。反應(yīng)條件：96 ℃預(yù)變性5 min，然后98 ℃變性45 s，65 ℃退火90 s，72 ℃延伸3 min，共25個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳條帶大小判斷基因型結(jié)果。

1.2.3 非缺失型α-地貧和β-地貧基因檢測(cè)：采用反向點(diǎn)雜交法（reverse dot blot，RDB）檢測(cè)3種α-地貧基因點(diǎn)突變（αCSα、αQSα、αWSα）和17種β-地貧基因突變位點(diǎn)（CD41-42、IVS-I I-654、CD17、CD27/28、-28、-29、Int、CAP、IVS-I-1、CD43、βE、CD31、CD14-15、CD71-72、-30、-32及IVSI-5）。PCR反應(yīng)體系：總體積25 μL，含PCR反應(yīng)液23 μL，DNA模板2 μL。反應(yīng)條件：50 ℃ 15 min，95 ℃ 10 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，72 ℃30 s，共25個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物通過雜交膜條斑點(diǎn)顯色特點(diǎn)確定基因型，正常斑點(diǎn)全部顯色且無異常突變斑點(diǎn)同時(shí)顯色為正常基因型，突變斑點(diǎn)及其相應(yīng)正常斑點(diǎn)同時(shí)顯色為突變雜合子，突變斑點(diǎn)顯色而相應(yīng)斑點(diǎn)不顯色則為突變純合子。

2 結(jié)果

共收集溫州地區(qū)疑似地貧患者991例，其中431例檢測(cè)出地貧基因，總陽性率為43.49%。155例檢測(cè)出帶有α-地貧基因，陽性檢出率為15.64%（占總陽性率的35.96%）；其中雜合子125例（占80.66%）、純合子2例（占1.29%）、雙重雜合子28例（占18.06%），見表1。α-地貧基因檢測(cè)部分結(jié)果見圖1-2。276例帶有β-地貧基因，共11種基因類型，陽性檢出率為27.85%（占總陽性率的64.04%）；其中雜合子259例（占93.84%）、純合子5例（占1.81%）、雙重雜合子12例（占4.35%），見表2。β-地貧基因檢測(cè)結(jié)果見圖3。7例αβ復(fù)合型地貧，陽性率為0.71%（占總陽性率的1.62%），見表3。

表1 α-地貧基因檢測(cè)結(jié)果[ n=155，n（%）]

圖1 GAP-PCR法檢測(cè)缺失型α-地貧基因結(jié)果

3 討論

圖2 RDB法檢測(cè)非缺失型α-地貧基因結(jié)果

本研究中991例標(biāo)本共檢測(cè)出431例攜帶地貧基因，陽性率為43.49%，其中α-地貧155例，包括--SEA、-α4.2、-α3.7、αCSα、αQSα 5種類型，陽性率為15.64%，β-地貧276例，包括CD41-42、IVSII- 654、CD17、CD27/28、-28、-29、Int、CAP、IVSI-1、CD43及βE共11種類型，陽性率為27.85%。最常見的α基因缺失類型為--SEA/αα，占所有α-地貧的67.10%。在檢測(cè)到的11種中國(guó)人常見的β-地貧基因突變類型中，以CD41-42所占比例最高，占所有β-地貧的35.87%，其次為IVS-I I-654、CD17以及CD27/28，分別占32.25%、16.67%、7.25%，其余類型相對(duì)較低，與何建維等[3]報(bào)道相似。本研究的樣本選自溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院和溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，這兩個(gè)醫(yī)院是溫州地區(qū)的三甲醫(yī)院，能反映溫州地區(qū)的地貧基因情況，溫州地區(qū)的β-地貧檢出率大于α-地貧，以β-地貧為主，與北京、重慶等地相同[4]，而與高發(fā)的廣東、廣西地區(qū)的情況則相反[5]，說明地貧具有高度遺傳異質(zhì)性，不同地域其基因突變不同，有著顯著的地域差異，不同地區(qū)人群中的發(fā)病率及遺傳背景有很大差異。同時(shí)本研究中溫州地區(qū)存在5例β-地貧純合子以及12例β-地貧雙重雜合子，β-地貧基因突變較復(fù)雜，加大了準(zhǔn)確診斷的難度。

α-地貧和β-地貧均可分為靜止型、輕型、中間型及重型4種，危害最大的是重型α-地貧和重型β-地貧。中間型α-地貧又稱HbH病，是α-地貧-1和α-地貧-2的雙重雜合子，是由于4個(gè)α基因中有3個(gè)有缺陷，此型臨床表現(xiàn)差異較大，出現(xiàn)貧血的時(shí)間和貧血輕重不一，避免這類患兒出生是地貧防治工作的重點(diǎn)和主要目標(biāo)。本研究中，共檢到28例HbH病患者，占地貧總檢出率的6.5%，以--SEA/-α3.7最為常見，占地貧總檢出率的4.41%。另外還有--SEA/-α4.2和--SEA/αCSα，分別占1.16%和0.93%。

表2 β-地貧基因檢測(cè)結(jié)果[ n=276，n（%）]

圖3 RDB法檢測(cè)β-地貧基因部分結(jié)果

表3 αβ復(fù)合型地貧基因檢測(cè)結(jié)果（n=7，n）

另外，本研究還檢測(cè)出7例αβ復(fù)合型地貧，陽性率為0.71%，主要為CD41-42的β基因突變復(fù)合α基因型，稍低于一些地區(qū)的檢出率。αβ雙重雜合子由于α-鏈和β-鏈的相對(duì)不平衡比單純的α-地貧或β-地貧雜合子有所減輕，其貧血癥狀反而會(huì)因此有所減輕。但是因這種雙重雜合子個(gè)體無論是與α-地貧還是β-地貧雜合子個(gè)體婚配，均有機(jī)會(huì)生育重型地貧患兒。因此，準(zhǔn)確判斷β-地貧復(fù)合α-地貧雙重雜合子對(duì)于遺傳咨詢和準(zhǔn)確進(jìn)行產(chǎn)前診斷具有重要意義[6]。

目前對(duì)于重型地貧患兒尚無有效的治療方法，只能對(duì)癥輸血或進(jìn)行干細(xì)胞移植[7]，但是干細(xì)胞移植配型困難而且費(fèi)用高，所以防止重型地貧患兒的出生顯得尤為重要。近年來可能由于生活水平的改善，重型地貧患者比原來存活時(shí)間更長(zhǎng)，而輕型地貧患者（攜帶者）因?yàn)闆]有明顯的臨床癥狀常常被漏診。若夫婦雙方均為同一類型輕型地貧基因攜帶者，每次懷孕，其子女有25%的機(jī)會(huì)為正常，50%的機(jī)會(huì)成為地貧基因攜帶者，另外還有25%的機(jī)會(huì)患上重型地貧；雖然地貧在我國(guó)南方分布廣泛，各省尚未將地貧篩查納入婚前和孕婦常規(guī)檢查項(xiàng)目，尤其近年取消了強(qiáng)制性婚檢制度等，這些綜合因素導(dǎo)致了群體中地貧的基因突變頻率和患病率增加。目前PCR方法結(jié)合RDB技術(shù)成熟，是臨床上檢測(cè)地貧的主要基因檢測(cè)方法，但目前我國(guó)疾病流行病學(xué)調(diào)查的嚴(yán)重缺乏與疾病實(shí)驗(yàn)研究的突出成績(jī)已形成巨大反差[8]。因此應(yīng)根據(jù)溫州地區(qū)流行病學(xué)資料進(jìn)行地貧突變類型的研究，在婚前、孕前及孕期積極廣泛篩查地貧，進(jìn)行地貧基因的產(chǎn)前診斷及基因分析，為進(jìn)一步進(jìn)行基因診斷和遺傳咨詢提供參考，以防止重型地貧患兒的出生，以指導(dǎo)優(yōu)生優(yōu)育，對(duì)提高人口素質(zhì)具有重要意義。

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[1] 郭華, 藍(lán)慧娟. 珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展[J]. 國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 2011, 32(10)： 1090-1092.

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Analysis of thalassemia gene mutation types in Wenzhou

XU Qiyu, ZHOU Wu, QIAN Jingjing, ZHOU Cui.
Department of Clinical Laboratory, the First Aff i liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou,325015

Objective： To investigate the gene mutation type and constituent ratio of thalassemia, so as to provide prenatal and postnatal care. Methods： Nine hundred and ninety one suspected thalassemia patients from the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University and the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University were included. GAP-PCR method and reverse dot blot (RDB) method were adopted to detect 3 common gene deletions in α-gene mutation and 3 point mutation in α-gene mutation, 17 common mutation sites in β-gene mutation. Results： From 991 suspected thalassemia patients, 431 thalassemia cases were detected(43.49%), including 155 α-thalassemia mutations and 276 β-thalassemia mutations. Southeast Asia deletion--SEA/αα (accounted for 67.10%) was the major types of α-thalassemia mutations. For β-thalassemia patients, the hot spots of mutation was CD41-42 (accounted for 35.87%). α-thalassemia combined with β-thalassemia were detected in 7 patients. Conclusion： α and β-thalassemia in populations of Wenzhou are complex. In order to provide valuable information with genetic counseling and clinical therapy, it is important to strengthen genetic diagnosis.

α-thalassemia; β-thalassemia; mutation types; point mutation

R446.1

B

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.11.014

2016-09-19

徐琦煜（1984-），女，浙江樂清人，主管技師。

賈建敏）