單/雙指數模型DWI評估裸鼠肺腺癌移植瘤早期化療療效的對比研究

鄒喬， 余煜棟， 包盈瑩， 萬齊， 陳后金， 張煥賢， 李新春

·實驗研究·

單/雙指數模型DWI評估裸鼠肺腺癌移植瘤早期化療療效的對比研究

鄒喬， 余煜棟， 包盈瑩， 萬齊， 陳后金， 張煥賢， 李新春

目的探討單、雙指數模型DWI評估裸鼠肺腺癌移植瘤早期化療療效的可行性和準確性，并篩選最佳參數。方法在48只雌性裸鼠中建立肺腺癌移植瘤模型，并將其隨機分為治療組A及對照組B，A組和B組分別采用腹腔內注射順鉑和生理鹽水。每組各隨機抽取4只裸鼠(AM組、BM組)于4個時間點(第0、3、7和10天)行體素內不相干運動成像(IVIM-DWI)，測量病灶的體積及表觀擴散系數(ADC)、真實擴散系數(D)、灌注分數(f)和灌注相關擴散系數(D*)。兩組各16只裸鼠(AP、BP組)分別在對應的4個時間點每次隨機抽取4只進行病理學檢查。比較各組不同時間點腫瘤體積和DWI參數值，并采用受試者工作特征曲線(ROC)分析各參數值的診斷效能。結果化療第3、7、10天AM組腫瘤的ADC和D值較BM組明顯升高，f值明顯降低(P<0.05)。化療第10天AM組腫瘤體積較BM組明顯縮小(P<0.05)，而第3、7天腫瘤體積的差異無統計學意義(P>0.05)。治療第3天各參數的ROC下面積依次是0.917(D)、0.833(ADC)和0.667(f)；以D值>1.02×10-3mm2/s作為閾值，敏感度和特異度分別為83.3%和100%；以ADC值>1.08×10-3mm2/s作為閾值，敏感度和特異度分別為66.7%和100%。病理檢查顯示，在化療第3、7和10天時AP組腫瘤細胞壞死和出血較BP組明顯增多，AP組微血管密度(MVD)及細胞增殖抗原67(Ki67)的表達水平隨時間延長而下降，AP組與BP組間MVD及Ki67表達水平分別在第7、10天及第3、7、10天時差異有統計學意義(P<0.05)。結論肺腺癌移植瘤化療后D、ADC和f值的改變早于腫瘤體積的變化；D值對肺腺癌早期化療療效的評價可能優于ADC值。

肺腺癌； 體素內不相干運動； 擴散加權成像； 化療； 早期療效； 動物實驗

目前對肺癌療效的評估主要基于實體瘤療效評價標準1.1(response evaluation criteria in solid tumors，RECIST)[1]，其實施方便、快捷，但存在隨訪時間長、存在一定的假陰性率等缺點。DWI作為一種可以檢測活體組織細胞內外水分子微觀運動的功能磁共振成像技術，可為肺癌的診斷及預后評估提供有價值的信息。文獻報道，基于多b值的體素內不相干運動(intravoxel incoherent motion，IVIM)DWI已經運用于臨床研究中，且較單指數模型更有優勢[2-3]，然而應用IVIM-DWI技術對肺癌化療療效進行評估的報道目前國內外較為少見。本研究前瞻性運用IVIM-DWI技術對順鉑治療前后的裸鼠肺腺癌進行評估，分析單、雙指數模型參數在監測肺腺癌早期化療療效中的可行性及準確性，旨在為臨床準確評價肺癌化療療效提供參考。

材料與方法

1.動物選取及人肺腺癌A549細胞株的培養

Balb/c-nu雌性裸鼠48只(購自廣東省醫學實驗動物中心，6～7周齡，20～22 g)飼養于廣州市呼吸疾病研究所的SPF級動物房。人肺腺癌A549細胞株(由廣州市呼吸疾病研究所賴克方教授課題組提供)置于加入10%胎牛血清的DMEM培養基中，在溫度37℃、濕度95%的CO2細胞恒溫培養箱中傳代培養。

2.人肺腺癌細胞模型的建立及分組

人肺腺癌A549細胞懸液的濃度為2×107個/mL，分別接種于所有裸鼠左側腹股溝皮下，0.1 mL/只，待腫瘤生長至短徑達(1.0±0.2) cm時即為建模成功。成瘤裸鼠隨機分為治療組A和對照組B，每組24只。A組每3天向裸鼠腹腔內注射1次順鉑(購于江蘇豪森藥業股份有限公司)，濃度0.2 mg/mL，劑量4 mg/kg，共注射3次；B組則于相同時間點向裸鼠腹腔內注射等量生理鹽水。A、B兩組中各隨機抽取8只裸鼠于注藥的第0、3、7和10日行MRI檢查，分別記為AM、BM組。兩組中各剩余16只裸鼠分別記為AP、BP組，于上述4個時間點各隨機選擇4只裸鼠在處死后進行病理學檢查。

3.MRI檢查及圖像后處理

使用Philip Achieva 3.0T多源超導型MR掃描儀。使用1%戊巴比妥鈉溶液(劑量5 mL/kg)對AM、BM組裸鼠麻醉成功后，置于8通道腕關節線圈內(含自制分隔裝置)。掃描序列和參數如下。①橫軸面精確頻率反轉恢復序列(spectral presaturation attenuated inversion recovery)T2WI：TR 2410 ms，TE 70 ms，矩陣200×143，激勵次數3；②冠狀面T1WI：TR 3000 ms，TE 100 ms，矩陣172×126，激勵次數3；③IVIM-DWI采用單次激發EPI和化學位移頻率選擇脈沖并SPAIR脂肪抑制技術：TR 758 ms，TE 54 ms，矩陣 64×58，b值11個(分別為0、20、40、60、80、100、200、400、600、800和1000 s/mm2)，激勵次數8；所有序列視野60 mm×60 mm，層厚3.0 mm，層間距0.0 mm。

將IVIM-DWI掃描數據導入隨機配置的IVIM后處理軟件中，生成相應的DWI參數圖，再使用Image J軟件進行后處理，參照T2WI上病灶的位置，在最高b值DWI圖像上于病灶內的高信號區勾畫ROI，ROI盡可能包括整個腫瘤，不避開壞死及出血區，不同參數圖上ROI的位置和大小盡量保持一致(圖1)。測量的DWI參數包括病灶的表觀擴散系數(ADC)、真實擴散系數(D)、灌注分數(f)和灌注相關擴散系數(D*)，每個參數測量3次記錄其平均值。同時在T2WI上測量腫瘤的長徑(a)和短徑(b)，按公式(1)計算腫瘤的體積(volume，V)：

V=a×b2×π/6

(1)

4.病理學檢查

將腫瘤標本常規石蠟包埋，4 μm連續切片，每份標本切片4張，常規行HE及免疫組化染色。免疫組化檢查采用Envision兩步法，腫瘤石蠟組織分別以CD34、Ki67鼠抗人單克隆抗體標記(均購于福州邁新生物技術開發有限公司)。微血管密度(microvessel density，MVD)計數采用Weidner技術，記錄5個高倍視野內的微血管數量，取其平均值作為該張切片的微血管計數結果。Ki67以胞核中出現棕黃色顆粒為陽性判定標準，染色結果綜合染色強度和陽性細胞數百分比進行半定量分析。染色強度以多數細胞呈現的染色特性計分：無色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。陽性細胞百分比(positive rate，PR)為某類細胞在5個視野內的陽性細胞百分比的平均數：PR≤5%計0分，5%50%計3分。染色強度與陽性細胞百分比兩項計分之和作為最終結果，0分為陰性(-)，1～2分弱陽性(1+)，3～4分中等陽性(2+)，5分以上強陽性(3+)。

5.統計學分析

表2 AM組與BM組不同時間點IVIM-DWI參數比較

注：*P<0.05，差異有統計學意義。

圖1 肺腺癌皮下移植瘤。a) SPAIR T2WI，腫瘤呈明顯高信號(箭)； b) DWI(b=1000s/mm2)，腫瘤呈明顯高信號(箭)； c～f) 分別為生成的D、f、D*和ADC圖，在相同位置全瘤劃取ROI(紅線)，不避開出血及壞死，分別獲得相應的D、f、D*和ADC值。

結 果

1.腫瘤體積及IVIM-DWI參數組間及組內比較

四個時間點腫瘤體積的測量值及統計分析結果見表1。AM組和BM組間僅在化療第10天時腫瘤體積的差異有統計學意義(P<0.05)。治療組(AM)中隨著化療時間的延長腫瘤體積表現為先增大后縮小，治療后第3天腫瘤體積達峰值，而至第10天時體積達最小；不同時間點組內兩兩比較結果顯示，治療后第3天與第10天時腫瘤體積的差異有統計學意義(P=0.036<0.05)。對照組(BM)中隨著時間的延長腫瘤體積緩慢增大，第10天時達高峰，且第0天與第10天時腫瘤體積的差異有統計學意義(P=0.035<0.05)。

表1 AM組和BM組在化療后不同時間點的腫瘤體積

不同時間點兩組中各參數的測量值及統計分析結果見表2、圖2。化療后第3、7、10天，AM組的ADC、D值較BM組明顯升高，f值較BM組明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。AM組中隨著時間點延長ADC和D值緩慢升高，且與基線值(第0天)間的差異均有統計學意義(P值分別為0.000、0.003和0.000，P均<0.05)。BM組內ADC、D值在各時間點之間兩兩比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。

2.ADC與D、f值的ROC比較

圖2 肺腺癌皮下移植瘤治療組化療第0、3、7和10天(1～4)時的SPAIR T2WI及ADC、D、f值的偽彩圖。a1～a4) 為SPAIR T2WI，顯示隨時間延長腫瘤體積逐漸縮小；b1～b4) 為ADC圖，顯示隨時間的延長腫瘤內壞死逐漸增多，擴散受限減輕，ADC值升高；c1～c4) 為D值圖，顯示隨著時間的延長，腫瘤內壞死增多，D值升高(呈綠色)；d1～d4) 為ADC圖，顯示隨著時間的延長腫瘤內血流灌注減少，f值降低(呈紫黑色)。

表3 不同時間點治療組與對照組MVD及Ki67的比較

注：*P<0.05，兩組間差異有統計學意義。

以化療后第3天ADC、D和f值的變化繪制肺腺癌裸鼠順鉑化療早期療效的ROC曲線(圖3)，曲線下面積依次是0.833、0.917和0.667。以D值>1.02×10-3mm2/s作為閾值，評估化療早期療效的敏感度和特異度分別為83.3%和100%；以ADC值>1.08×10-3mm2/s作為閾值，評估化療早期療效的敏感度和特異度分別為66.7%和100%；以f值<3.30%作為閾值，評估化療早期療效的敏感度和特異度分別50%和100%。

4.病理組織學改變

HE染色光鏡下表現：AP組化療后隨著時間的延長腫瘤內壞死、出血增加，并于第10天時達高峰(圖4)。BP組隨著時間的延長，可見腫瘤細胞分布更密集，未見明確的壞死區域。

不同時間點組治療組和對照組的免疫組化檢查結果見表3和圖5～6。化療后第0和3天時AP組與BP組間MVD計數的差異無統計學意義(P>0.05)，化療后第7和10天時AP組的MVD計數較BP組明顯降低(F值均為，P<0.05)；化療后第0天時AP組與BP組間Ki67表達水平間的差異無統計學意義(P>0.05)，化療后第3、7和10天時AP組的Ki67表達水平均較BP組明顯降低(F值分別為1.000、0.000和9.000，P均<0.05)；而AP組和BP組內MVD計數和Ki67表達水平在各時間點之間比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。

圖3 ROC曲線，顯示ADC(黃色)、D(綠色)和f值(紅色)的AUC依次為0.833、0.917和0.667。

圖4 治療組中不同時間點腫瘤的病理圖(×200，HE)，顯示隨著治療時間的延長，腫瘤組織內腫瘤細胞的密度降低，壞死、出血增多。a) 第0天； b) 第3天； c) 第7天； d) 第10天。 圖5 治療第10天MVD免疫組化染色，光鏡下顯示血管內皮細胞呈棕褐色，AP組微血管數明顯少于BP組(×400)。a) AP組； b) BP組。圖6 治療第10天Ki67免疫組化染色，光鏡下顯示腫瘤細胞的胞核中出現棕黃色顆粒，AP組染色陽性的細胞數明顯少于BP組(×400)。a) AP組； b) BP組。

討 論

本研究采用11個b值的IVIM單/雙指數模型，結果顯示在化療后第3天時治療組的ADC和D值較對照組顯著升高、f值較對照組明顯降低，提示ADC、D和f值能夠早期監測腫瘤化療療效，與Cui等[4]的研究結果基本一致。本研究中，在化療后第7天時治療組的MVD計數較對照組明顯減低(P<0.05)，并且隨著治療時間的延長，治療組中MVD計數進一步降低。在化療后第3、7和10天時治療組的Ki67表達水平較對照組明顯降低(P<0.05)，并且隨著治療時間的延長而下降。本研究結果提示，IVIM參數的改變與病理學的改變基本一致。

據史紅媛等[5]報道，裸鼠人肺腺癌模型在恩度治療后第3天時，治療組的ADC值明顯高于對照組，判斷化療有效的ADC閾值為(0.79±0.03)×10-3mm2/s。本研究中，在化療第3天時評價裸鼠肺腺癌化療有效的ADC閾值為1.08×10-3mm2/s，低于史紅媛等的報道，推測可能與化療藥物、掃描序列及場強等因素不同有關。

IVIM是基于雙指數模型的DWI技術，近年來其在胰腺腫瘤、腦轉移瘤和前列腺癌等疾病中的作用已經得到肯定[6-8]。本研究結果顯示，D和f值對判斷肺腺癌裸鼠化療早期療效具有一定價值。據Cui等[6]報道，荷人鼻咽癌裸鼠在采用易瑞沙二代zactima(ZD6474)治療后第3天，治療組中D值明顯升高，與本組研究結果一致；但是該研究顯示，在治療后第1天時治療組的f和D*值較對照組明顯減低(P<0.05)，而本研究中，在化療后第3天時治療組與對照組間f值的才出現顯著差異(預實驗結果顯示化療后第1天時IVIM參數的組間及組內差異無統計學意義，故觀察時間點未選擇化療后第1天)。上述不同研究間結果存在的差異及其意義，尚需要大樣本的研究進行進一步驗證。本研究中，D*值不能作為監測肺癌化療療效的有效指標，推測可能與D*值的可重復性較差[9]以及與其它研究中所采用動物模型的腫瘤類型、治療藥物不同等因素有關。

較多文獻報道，對腫瘤形態學的監測不能準確評價早期化療的療效。Brahmer等[10]報道28例非小細胞肺癌患者在初次納武單抗(Nivolumab)治療后經RECIST 1.1標準判定為腫瘤進展，繼續采用Nivolumab治療后仍有9例患者能夠繼續獲益。Park等[11]的研究亦證實，非小細胞肺癌患者在RECIST 1.1評估為腫瘤進展后繼續應用厄洛替尼治療，可將無進展生存時間再延長3.1個月[11]。本研究中，治療組中隨治療時間的延長腫瘤體積呈現先增大(第3天達高峰)、后縮小的規律，組內比較，僅化療后第3天與第10天時的腫瘤體積的差異具有統計學意義，余組內兩兩比較體積的差異均無統計學意義；對照組中腫瘤體積表現為隨時間延長而緩慢增大，組內比較，僅在第0天與第10天時腫瘤體積的差異有統計學意義；而組間比較時，僅在化療后第10天時腫瘤體積的差異有統計學意義，提示腫瘤體積出現差異的時間明顯晚于DWI參數(ADC、D、f)值的改變，表明腫瘤在治療后功能的改變早于形態學的改變，提示采用IVIM功能參數監測肺腺癌裸鼠化療療效要優于對體積的監測，可作為肺癌化療療效監測的可靠指標。

有文獻報道，雙指數模型DWI在疾病的診斷和隨訪過程中的價值比單指數模型更佳[12-13]。本研究結果顯示，在化療后第3天時以D值判別腫瘤治療療效的ROC曲線下面積最大，其次是ADC和f值，提示D值對評估肺腺癌裸鼠早期化療療效的診斷效能最高，亦提示雙指數模型DWI對惡性腫瘤早期化療療效的監測價值優于單指數模型，與Xiao等[14]的觀點一致。但是，雙指數模型中各定量參數的診斷效能，在不同的研究間結果不盡相同[12, 15]，尚需大樣本量的研究進一步證實。

總之，化療后肺癌的IVIM-DWI參數值的變化早于腫瘤體積的變化，且這些參數值的變化規律與病理學改變基本一致，可作為預測肺癌化療療效的可靠的定量指標；雙指數模型的D值對肺腺癌裸鼠早期化療療效的評價效能可能優于單指數模型的ADC值。

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Diffusion-weightedimagingformonitoringtheearlyresponseoflungadenocarcinomaxenograftinnudemousetochemotherapy：acomparativestudyofmonoexponentialandbiexponentialmodels

ZOU Qiao,YU Yu-dong,BAO Yin-ying,et al.

Department of Radiology,the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University,Guangzhou 510120,China

Objective:To study the feasibility and accuracy of mono-exponential and bi-exponential models DWI for evaluating the curative effect of chemotherapy on lung adenocarcinoma xenograft in nude mice,and to select the optimal quantitative parameters.MethodsTransplantation tumor model of human lung adenocarcinoma was established in 48 female BALB/c nude mice,and the nude mice were randomly divided into two groups.In group A,cisplatin was administered by intraperitoneal injection,meanwhile the equivalent sterile saline was administered in group B.Four mice were selected randomly from group A and four in group B (named as AMand BMgroup),and IVIM-DWI scanning was performed immediately at baseline,3th,7th and 10th day,the DWI parameters including ADC,D,f and D*values and tumor volume were calculated.The rest of the 32 mice were randomly divided into APand BPgroup (n=16 for each),4 mice were selected randomly from APand BPgroup respectively to undergo pathology examination in different observation time.The changes of tumor volume and DWI parameters of different groups were compared at every time points.The receiver operating characteristic curve (ROC) was applied to significant parameters to compare the area under the curve and calculate their sensitivity and specifi-city.ResultsThe ADC and D values of tumor in AMgroup were significantly higher while f value was significantly lower than those in BMgroup at the 3th,7th and 10th day after chemotherapy (allP<0.05).In AMgroup,the tumor volume was significantly decreased than those of BMgroup at the 10th day (P<0.05).The area under curve was 0.917 for D,0.833 for ADC,0.667 for f value at the 3th day after treatment.When D value>1.02×10-3mm2/s,ADC value>1.08×10-3mm2/s,the corresponding sensitivity and specificity were 83.3% and 100%,66.7% and 100%,respectively.In APgroup the tumor necrosis and hemorrhage were significantly increased than those in BPgroup at the 3th,7th and 10th day,In APgroups,MVD value decreased and was significantly lower than those of BPgroups at the 7th and 10th day,while Ki67 at the 3th,7th and 10th day (P<0.05).ConclusionD,ADC and f value of subcutaneous transplantation tumor model of lung adenocarcinoma changed earlier than tumor volume after chemotherapy of lung cancer.The D value derived from biexponential may be superior to the ADC from monoexponential model in evaluating the efficacy of chemotherapy in nude mice.

Lung adenocarcinoma； Intravoxel incoherent motion； Diffusion-weighted imaging； Eearly therapeutic effect； Animal experiment

510120 廣州，廣州醫科大學附屬第一醫院放射科(鄒喬、余煜棟、包盈瑩、萬齊、李新春)，放療科(張煥賢)；100044 北京，北京交通大學電子信息工程學院(陳后金)

鄒喬(1988-)，男，新疆庫爾勒人，碩士，住院醫師，主要從事腫瘤影像診斷及磁共振功能成像工作。

李新春，E-mail：xinchunli@163.com

國家自然科學基金(81601457)；廣東省醫學科研基金項目(A2016410)；廣州市科技計劃項目(201510010234)；廣州市醫藥衛生科技項目(20151A011066)

R445.2； R734.2

A

1000-0313(2017)12-1242-06

10.13609/j.cnki.1000-0313.2017.12.008

2017-05-31

2017-09-04)