痤瘡患者和健康人群痤瘡丙酸桿菌多序列位點分型分子流行病學研究

楊娥 李歡 劉艷 徐紀茹

[摘要]目的：本研究擬通過多序列分型（MLST）方法研究是否存在某些和痤瘡發病密切相關的基因型。方法：分離培養痤瘡患者和健康志愿者皮膚中的痤瘡丙酸桿菌株，進行管家基因擴增、測序、比對，比較不同來源的菌株的基因型、親緣關系及分子流行病學特征。結果：痤瘡患者和健康志愿者皮膚標本痤瘡丙酸桿菌檢出陽性率分別為80.49%和80.77%，差異無統計學意義（P>0.05）。來自健康志愿者的21個菌株可以被分為8個序列類型（ST），分別是ST3、ST8、ST9、ST10、ST18、ST26、ST27和ST46；而來自于患者的33個菌株僅被分為3個ST，它們是ST3、ST26和ST28。結論：痤瘡的發生和皮膚中痤瘡丙酸桿菌的陽性檢出率并無明顯關系，但來自于痤瘡患者菌株的ST生物多樣性明顯降低，ST28等基因型與痤瘡的發病密切相關。

[關鍵詞]痤瘡丙酸桿菌；多位點序列分型法；分子流行病學；痤瘡

[中圖分類號]R758.73+3 [文獻標志碼]A [文章編號]1008-6455（2018）10-0125-04

Abstract： Objective To assess if certain Propionibacterium acnes STs have closed relationship to the developing of acne. Methods Propionibacterium acnes strains isolated from patients with acne and healthy controls were testified by multilocus sequence typing（MLST）， and phylogenetic analysis was carried out with MEGA7 software. Results The positive rates of Propionibacterium acnes in the skin samples of patients with acne and healthy volunteers was 80.49% and 80.77%， respectively， and the difference was not statistically significant（P>0.05）. The 21 strains isolated from volunteers were categorized into 8 different sequence types（STs）， include ST3， ST8， ST9， ST10， ST18， ST26， ST27， ST46 and the 33 strains isolated from patients were only categorized into 3 STs， include ST3， ST26 and ST28. Conclusion There was no significant relationship between the occurrence of acne and the detection rate of Propionibacterium acnes. The STs diversity of Propionibacterium acnes from acne patients were significantly reduced， and strains such as ST28 seems to be closely related to the occurrence of acne.

Key words： Propionibacterium acnes； multilocus sequence typing； molecular epidemiology； acne

尋常痤瘡是一種常見的毛囊皮膚慢性炎癥性疾病，受累人群主要是青少年及20～30歲成年人，發病率高，臨床表現多樣，從生理性粉刺到炎癥性丘疹、膿皰、結節、囊腫，嚴重程度和持續時間也因人而異。痤瘡的病因較復雜，目前尚未完全明了，很多因素都參與了痤瘡的發病，其中內分泌因素、微生物因素、皮脂腺導管的異常角化、免疫因素、精神因素、遺傳因素等在痤瘡的發病中起了重要的作用[1]。但是在痤瘡發病的各個階段，總是伴隨著或輕或重的炎癥反應，當痤瘡發生時，局部毛囊皮脂單位中，痤瘡丙酸桿菌、白色葡萄球菌及金黃色葡萄球菌等細菌的生長明顯增多，抑制它們的生長，痤瘡的癥狀可以得到部分緩解，這說明微生物因素在其中的重要性。其中與痤瘡關系最為密切的是痤瘡丙酸桿菌，研究表明，該菌可以促進皮膚角栓形成、皮脂過度分泌、刺激炎癥應答激活等，在痤瘡發生和發展中扮演著重要的作用[2]。

多位點序列分型（Multilocus sequencing typing， MLST） 是一個具有很高分辨能力的微生物分子流行病學分析方法[3]，它是由多位點酶電泳MLEE衍生出來的一種分型方法，通過對微生物多個管家基因（一般為6～11個位點）的片段進行序列測定，來揭示每個位點等位基因的多樣性，并根據各位點不同等位基因的排列組合譜所形成的序列類型（Sequence type，ST），來提供細菌基因組信息，在追查病原菌的傳染源、傳播途徑等方面均有重要意義。本研究通過分離培養患者及健康人群皮膚標本中痤瘡丙酸桿菌，進行核酸多序列分型，研究該菌的基因分型與痤瘡臨床疾病的關系，為指導臨床治療提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 標本收集：41例尋常痤瘡患者用自來水清洗局部皮膚后，選取未破損痤瘡皮損用70%的酒精進行消毒，用滅菌粉刺針擠出痤瘡內容物至無菌采樣拭子，而后采用分區劃線法接種于布魯氏菌血瓊脂（Brucella blood agar，BBA）平板。26例健康志愿者采用無菌PBS浸濕棉拭子，于面部前額正中選擇4cm×4cm區域由內向外稍用力涂抹采集樣本，分區劃線法接種于BBA平板。

1.2 痤瘡丙酸桿菌的分離、培養及鑒定：將BBA平板置于厭氧罐中37℃恒溫培養72～96h，觀察瓊脂表面是否有肉眼可見的淡黃色、半透明、圓形、凸起的菌落生長。選取可疑菌落進行革蘭染色鏡檢，將鏡下呈現革蘭陽性、分節狀排列、呈雜亂粗大桿菌的單菌落進行雙份轉種，一份繼續厭氧培養，另一份使用VITEK2全自動細菌鑒定系統進行菌株鑒定。

1.3 細菌全基因組DNA提?。悍蛛x、培養鑒定到的54株痤瘡丙酸桿菌臨床株，使用北京TIANGEN公司細菌基因組提取試劑盒提取全基因組DNA，0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測，-20℃冰箱保存備用。

1.4 PCR擴增管家基因：用于PCR擴增的引物序列參照Http：//pacnes.mlst.net/，實驗中分析的9個管家基因及其編碼產物如下：cel（Transcription regulator ），轉錄調節因子；coa（O-succinylbenzoate-CoA synthase），O-琥珀酰苯甲酸-CoA合成酶；fba（Fructose bisphosphate aldolase），果糖二磷酸醛縮酶；gms（Glutamyl-tRNA synthetase），谷氨酰-tRNA合成酶；lac（L-lactate dehydrogenase）， L-乳酸脫氫酶；oxc（Cytochrome C Oxidase Subunit Ⅱ），細胞色素C氧化酶亞基Ⅱ；pak（Pantothenate kinase），泛酸激酶；recA （Recombinase A），重組酶A；zno（Zn-dependant alcohol dehydrogenase），鋅依賴性醇脫氫酶。實驗所用引物見表1，由北京博奧生物公司合成。

除recA基因以外的其他8個基因PCR反應條件如下：96℃預變性40s；94℃ 35s，55℃ 40s，72℃ 40s，35個循環；72℃延伸7min。recA基因的PCR反應條件如下：95℃預變性3min；95℃ 1min，55℃ 30s， 72℃ 90s，35個循環；72℃延伸10min。PCR產物采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。純化后送上海生工生物工程技術公司雙向測序。測序和PCR反應采用同樣的引物，所得序列采用Laser-gene 7.0軟件包的SeqMan軟件進行拼接和分析。

1.5 MLST序列分析：每個管家基因的測序結果通過與Http：//pacnes.mlst.net/網站上痤瘡丙酸桿菌的等位基因序列進行比對，確定所測基因的等位基因類型，得到9個等位基因的組合之后，與網站上等位基因排列組合譜進行比較，即得到實驗菌株的ST信息。

1.6 親緣關系分析：基于MLST 9個等位基因測序信息，利用MEGA7軟件采用鄰位相連法（Neighbor-joining，NJ）對所分離菌株進行親緣關系分析。

2 結果

2.1 痤瘡丙酸桿菌陽性檢出率：本次實驗共收集了54株痤瘡丙酸桿菌，其中33株來自于41例臨床痤瘡患者，21株來自于26例健康志愿者，患者和健康志愿者標本中痤瘡丙酸桿菌的陽性檢出率分別為80.49%和80.77%，該菌在痤瘡患者和健康志愿者中的檢出率比較，差異無統計學意義（P>0.05）。

2.2 PCR擴增管家基因：以54株痤瘡丙酸桿臨床分離株的基因組DNA為模板，進行9個管家基因PCR擴增，結果如圖1顯示，PCR產物均條帶清晰，目的片段同預期大小一致（DNA Marker為Takara公司的DL2000）。

2.3 MLST分型檢測結果：54株菌的9個管家基因PCR產物進行核酸序列測定，序列拼接后與Http：//pacnes.mlst.net/數據庫進行比對，如表2所示，這些菌株可以被分為 9個ST，其中來自于健康志愿者的21個菌株可以被分為8個ST，分別是ST3（4例）、ST8（2例）、ST9（3例）、ST10（3例）、ST18（2例）、ST26（2例）、ST27（3例）、ST46（2例）；而33株分離自患者標本的痤瘡丙酸桿菌僅可被分為3個ST，分別是ST3（13例）、ST26（6例）和ST28（14例）。

2.4 菌株間親緣關系分析結果：根據MLST分型結果，利用MEGA7軟件采用鄰位相連法對本次試驗中檢測到的9個痤瘡丙酸桿菌基因型的親緣關系進行分析，結果見圖2。

3 討論

痤瘡是一種毛囊皮脂腺的慢性炎癥性疾病，因其主要發生于面部，易反復發作，可以導致瘢痕形成，色素沉著，嚴重影響美觀，給患者帶來一系列社會及心理問題從而越來越受到重視[4]。痤瘡丙酸桿菌是皮膚生物膜微生物群落的重要組成部分，也是一種機會致病菌。長期以來，人們對于該菌在痤瘡的發病過程中到底有何作用具有一定爭議。但是來自多中心的臨床研究均表明，作用于痤瘡丙酸桿菌的不同抗生素、抗菌劑和細菌素是治療痤瘡的有效方法，說明該菌在痤瘡發病中應該占有一席之位。

本研究發現，患者痤瘡皮損處和健康志愿者皮膚標本中痤瘡丙酸桿菌的檢出率均比較高，分別為80.49%和80.77%，統計學分析并無顯著性差異，痤瘡患者的毛囊中并沒有比正常人群具有更多的痤瘡丙酸桿菌，說明該菌的陽性率顯然不是決定痤瘡發病的首要因素。利用基于高通量測序的宏基因組研究也同樣發現[5]，痤瘡丙酸桿菌是皮膚微生物群中最主要和最豐富的細菌，其相對豐度在痤瘡和痤瘡患者中是相似的（87%～89%），并無明顯差異。所以可以推測來自于這兩類人群的痤瘡丙酸桿菌臨床分離株遺傳背景應當存在一定差異，某些痤瘡丙酸桿菌菌株可能是真正的皮膚共生菌，有助于皮膚健康，而某些菌株則有可能充當機會致病菌誘發痤瘡。除了細菌因素外，痤瘡患者還普遍存在皮脂分泌過多的問題，這可以造成毛囊皮脂腺淤積即脂肪栓形成，局部微環境中氧分壓下降，從而有利于痤瘡丙酸桿菌的增殖。而痤瘡丙酸桿菌又可以攝取皮脂中的甘油三酯作為營養物質進行生長繁殖，產生很多胞外酶如包括脂酶、蛋白酶、透明質酸酶等，從而加重痤瘡毛囊局部的炎癥。并促進毛囊漏斗部角化增強形成粉刺，進一步導致皮脂排泄不暢，加重了毛囊皮脂腺過度增生，從而有利于痤瘡的發生和發展[6]。

基于管家基因測序分析的MLST分型方法簡單，快速，重復性好，分辨率高，結果準確，可用于研究幾乎所有細菌（特別是難以培養的細菌），并可直接用于檢測細菌培養陰性的可疑臨床標本。由于其數據源于高通量核苷酸序列測定技術，故易于對來自于不同實驗室的數據進行快捷的比較分析，被認為是進行大規模全球性流行病學研究“金標準”，更易于解釋菌株與流行病學之間的相關性，也易于在不同實驗室間作分析比對[7]。

通過MLST基因分型方法發現，定植在痤瘡患者與健康人毛囊皮脂腺處的痤瘡丙酸桿菌菌株存在差異。來自健康人群標本中的痤瘡丙酸桿菌的序列類型具有更豐富的生物多樣性，21株臨床分離株的基因型可以被分為8個ST，分別是ST3（4株）、ST8（2株）、ST9（3株）、ST10（3株）、ST18（2株）、ST26（2株）、ST27（3株）、ST46（2株）；而從患者標本中分離培養到的痤瘡丙酸桿菌菌株的生物多樣性大大降低了，33株臨床分離株的基因型集中在3個ST，分別為ST3（13株）、ST26（6株）和ST28（14株），這說明痤瘡病變的發生僅與某些特定ST的菌株有關。雖然本研究中ST3和ST26也見于健康人群，但是在痤瘡患者中更為常見，而ST28在本次研究中只見于痤瘡患者，同樣說明健康志愿者和痤瘡患者皮膚分離到的痤瘡丙酸桿菌菌株的多樣性和主要ST類型均存在差異。對于分離到ST3和ST26的健康志愿者，應當進行后續的回訪，觀察他們是否有可能會發生痤瘡。

基于MLST的痤瘡丙酸桿菌的研究自從Lomholt HB等2010年建立了9個管家基因的方法學以來[8]，取得了很多進展。研究結果顯示，不同地區、不同種族痤瘡患者的痤瘡丙酸桿菌基因型存在差異。點突變導致痤瘡丙酸桿菌出現新等位基因比重組的多1.5倍，eST3和痤瘡的發生高度相關，尤其是rRNA變異的eST3更常見且與耐藥菌株密切相關，而CC72 （type Ⅱ） and CC77 （type Ⅲ）僅僅見于健康人群[9]；CC18是導致背部痤瘡的優勢克隆復合體，特別是與高加索地區人群的痤瘡發病密切相關[10]；前列腺癌標本中的優勢克隆復合體是CC53/60和CC36[11]。ST1和ST3與痤瘡丙酸桿菌的耐藥性密切相關[12]且ST3基因型菌株可以在人單核細胞中誘導產生促炎因子如IFN-γ和IL-17[13]，從而更容易適應高活性脂溢性皮腺皮膚，加重痤瘡的發生。

在對本研究中的痤瘡丙酸桿菌親緣關系分析發現，ST9、ST10、ST8、ST18這些菌株的親緣關系比較密切，它們僅見于健康志愿者。而ST3、ST26、ST28和ST27親緣關系更為密切，后四種ST中，ST3、ST26和ST28都是在痤瘡患者中更多見，這進一步說明痤瘡的發生和發展可能與痤瘡丙酸桿菌菌株的ST差異有一定關系，這幾個基因型和痤瘡發生的關系如何尚需要進一步擴大樣本量來進行深入研究，或者進行動物實驗驗證，所得結果可為臨床痤瘡的防控提供理論依據。

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[收稿日期]2018-07-12 [修回日期]2018-09-14

編輯/朱婉蓉