殼聚糖支架負載SHH和CM—Dil標記的脂肪干細胞移植后存活分化研究

羅鳴驁 伍尚敏 蘇曉三 高嘉 于璐 王翼寅 甘鳳山

[摘要]目的：觀察殼聚糖支架負載音猬因子（Sonic hedgehog，SHH）和脂肪干細胞（adipose-derived stem cells， ADSCs）移植后，ADSCs存活分化的效果。方法：將健康C57BL/6小鼠隨機分為A組（PBS+ADSCs）、B組（SHH+ADSCs）、C組（殼聚糖+ADSCs）、D組（殼聚糖+SHH+ADSCs）。將各組混合物分別注射到小鼠背部皮下。術后1、2、4、8周處死小鼠，通過對移植組織一般觀察、熒光顯微鏡觀察、HE染色、免疫組化染色來評價移植細胞存活分化的情況。結果：術后8周，殼聚糖支架完全降解，大體觀察、HE染色、免疫組化染色均說明殼聚糖支架同時搭載SHH和ADSCs脂肪干細胞存活率較高，新生血管增加，效果均優于A、B、C三組。結論：殼聚糖支架同時負載SHH和ADSCs可有效促進干細胞存活，顯著增加血管組織數量。

[關鍵詞]可注射性；殼聚糖；音猬因子；脂肪干細胞；干細胞移植

[中圖分類號]R329 [文獻標志碼]A [文章編號]1008-6455（2018）10-0129-04

Abstract： Objective The aim of our research is to observe the survival and differentiation of adipose Derived stem cells after transplantation with injectable chitosan scaffold loaded with SHH and adipose stem cells. Methods Thirty healthy C57BL/6 mice were selected. Random division group A mixture of PBS and ADSCs，group B mixture of SHH and ADSCs，group C chitosan scaffold loaded with ADSCs，group D chitosan scaffold loaded with SHH and ADSCs.After 1，2，4 and 8 weeks analysis involved general observation，HE staining，immunohistochemical staining of the survival and differentiation of transplanted cells. Results Eight weeks after operation， chitosan scaffold were completely degraded. After 8 weeks，analysis involved general observation，HE staining and immunofluorescence staining showed that Chitosan scaffold loaded with SHH and ADSCs could effectively increase the survival rate of adipose stem cells，increase angiogenesis. All the results were better than that of A、B、C group. Conclusion Chitosan scaffold loaded with SHH and ADSCs can effectively promote the survival of stem cells and spontaneously differentiate into mature adipocytes and increase the number of vascular tissues.May serve as a promising strategy for improving the survival of ADSCs graft survival rate.

Key worlds： syringeability； chitosan； SHH； adipose stem cells； stem cell transplantation

自體游離脂肪是臨床上較安全的軟組織修復填充材料，但脂肪移植后微血管被破壞，組織處于缺血期，導致細胞死亡[1]，致其存活率降低，臨床應用受到極大限制。脂肪干細胞以其來源豐富、易獲取、能在體外多代穩定增殖、具有多向分化潛能、免疫相容性好、取材對患者損傷小等優點已成為臨床研究熱點[2-3]。單純干細胞移植，因細胞缺乏粘附點呈漂浮狀態，即缺乏良好的移植微環境，不利于細胞的存活和正常功能的發揮。殼聚糖因其生物降解性、非抗原性、無毒性，抗菌活性以及良好的生物粘附性和細胞親和力，被廣泛用作細胞載體[4]。本實驗將ADSCs同時或分別混合SHH和殼聚糖支架，注射入小鼠的背部皮下，觀察細胞移植后存活分化的效果。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及材料：實驗動物：健康雌性C57BL/6小鼠20只，體重18～22g，由昆明醫科大學實驗動物學部提供。主要試劑：胎牛血清（德國Capricorn Scientific），L-DMEM培養基（美國hyclone），DMSO（美國sigma），PBS（美國gibco），D-PBS（美國gibco），I型膠原酶（北京索萊寶科技有限公司），CM-Dil（美國Invitrogen），SHH（美國R&D;），即用型一抗（丹麥Dako），殼聚糖（美國sigma），tunel試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠ADSCs原代培養及鑒定：C57BL/6小鼠斷頸處死后取腹股溝處脂肪組織，參照陳軍等[5]的方法進行ADSCs的分離培養，傳至第五代，行流式細胞儀檢測及成脂成骨分化鑒定。

1.2.2 殼聚糖支架的制備：參考伍尚敏等[6]殼聚糖備制流程加以改進，在磁力攪拌結束后，將溶液加入12孔細胞培養板孔中，1ml/孔。置于-20℃中過夜，取出后冷凍干燥48 h。用75%乙醇浸泡0.5h滅菌，并剪碎為小顆粒，PBS浸洗3次，15min/次，最后在密封條件下紫外燈照射20min。

1.2.3 CM-Dil染色：將消化后的細胞用PBS沖洗兩次。標記液50?g CM-Dil加入0.025ml二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO），用D-PBS配制為5?g/ml染液，將細胞與染液混合，37℃溫箱孵育20min，4℃冰箱孵育15min。標記成功后PBS再次沖洗，用PBS配制成混合懸濁液備用。

1.2.4 實驗分組及手術：隨機分為4組：即A組：空白對照組（PBS+ADSCs）、B組：干細胞-SHH組（ADSCs+SHH）、C組：殼聚糖-干細胞組（殼聚糖+ADSCs）、D組：實驗組（殼聚糖+SHH+ADSCs），每組小鼠各5只。將CM-Dil標記的ADSCs與殼聚糖支架及SHH混合，混合物SHH終濃度300?g/L，用注射器吸取ADSCs-SHH-殼聚糖支架，1%戊巴比妥鈉70?l/只，腹腔注射麻醉小鼠，選取背部四點（每點含干細胞數目約為8×105個），將混合物注射入小鼠背部皮下，注射完可見到皮下有輕微隆起，其余各組移植方法相同。

1.3 觀察指標

1.3.1 標本處理和組織學觀察：OCT組織包埋劑包埋后制作冰凍切片，熒光顯微鏡觀察。其余組織使用多聚甲醛溶液固定脫水后制成蠟塊。

1.3.2 HE染色：取上述各組組織石蠟切片，蘇木精-伊紅常規染色，觀察計數完整的細胞數。

1.3.3 免疫組化染色檢測CD31、CD34及計數：石蠟切片使用二甲苯脫蠟，乙醇逐級脫水。微波修復抗原，PBS沖洗；3%過氧化氫封閉內源性過氧化氫酶，一抗過夜孵育，PBS沖洗；二抗孵育，PBS，DAB顯色，蘇木精復染，鹽酸酒精分化。脫水、透明、封片、鏡檢。標本組織HE染色切片，CD31、CD34免疫組化切片均使用Precipoint M8掃描，然后使用網格測試系統，在400倍鏡視野下隨機選擇5個視野計數陽性細胞。

1.4 統計學方法：采用SPSS 19.0統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差（x?±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ADSCs流式檢測成骨成脂誘導分化：鏡下觀察細胞呈梭形或多邊形。流式結果顯示CD44、CD90高表達，CD34、CD45低表達（見圖1），同時成脂成骨分化鑒定（見圖2），證實培養細胞為ADSCs。

2.2 殼聚糖支架的性能：電鏡下觀察殼聚糖支架呈現疏松多孔結構（見圖3a），且殼聚糖支架與ADSCs共同培養結果顯示ADSCs可以大量存活并粘附于殼聚糖支架表面（見圖3b）。

2.3 熒光顯微鏡結果：組織冰凍切片觀察顯示脂肪干細胞大量存活，白光下可見被染色的干細胞（見圖4a），在同一視野熒光顯微鏡下，呈現較強的紅色熒光（見圖4b）。第四周仍可見熒光存在。

2.4 HE染色：干細胞在殼聚糖支架周圍及內部大量存活，較單純移植組細胞存活更多。第4周脂肪干細胞逐步分化為脂肪細胞，并形成以殼聚糖干細胞混合體為核心的發生中心（見圖5）。第8周殼聚糖已被完全降解，在40倍鏡下對完整細胞進行計數顯示各組存活移植細胞數差異均有統計學意義，除C、D組P<0.05，其余各組均P<0.01。殼聚糖同時負載SHH與ADSCs組與其他組相比存活細胞數顯著提高（P<0.05），差異具有統計學意義（見圖6）。

2.5 免疫組化結果：各組脂肪組織切片上均可見被標記為棕色的細胞。由于ADSCs的CD31、CD34表達均呈陰性，可以判斷標記細胞為新生血管內皮細胞。CD31顯示第1周實驗組分化出大量新生血管內皮細胞，分布廣泛均勻（見圖7a），各組新生內皮細胞數量之間比較差異均有統計學意義（P<0.01）。CD34顯示第8周實驗組已形成大量單層內皮新生血管組織（見圖7b），各組血管內皮細胞數量之間比較差異均有統計學意義，除B、C組P<0.05，其余各組P<0.01（見圖8）。

3 討論

自體脂肪組織移植是整形外科手術中增加組織體積和輪廓缺損的一種安全而簡便的選擇[7]。但自體脂肪移植存在注射后吸收率高，脂肪細胞易死亡，液化壞死的脂肪組織可導炎癥及感染等諸多問題[8]。

本實驗運用的脂肪干細胞（ADSCs）是從脂肪組織中分離的一種間充質干細胞，具有多向分化潛能[9]，脂肪干細胞相對于成熟脂肪細胞具有強大的增殖分化潛力，對缺氧耐受力更強，且自體干細胞用于移植可避免排異反應，更加安全。脂肪干細胞來源豐富，提取方便，創口小，可與抽脂手術同時進行，且脂肪干細胞能自發地或經誘導分化為脂肪細胞[10]。Zhang等[11]實驗證明體內移植的脂肪干細胞完全代謝大約需要28d，本實驗在注射ADSCs后檢測周期遠大于28d，達到8周，這樣既可以保證干細胞充分發揮其作用，也可以在一定程度上了解其遠期效果。本實驗應用CM-Dil熒光染料為移植脂肪干細胞的示蹤劑，其是一種親脂性染料，不溶于水，不從已標記的細胞轉移到未標記的細胞，對活體細胞沒有任何毒性[12]。

本實驗應用的殼聚糖支架原料脫乙酰殼聚糖是一種從甲殼類生物外骨骼中提取的天然線性多糖，具有良好生物官能性和相容性。在體內不積累，無免疫原性，可在體內溶菌酶、甲殼酶的作用下水解成對人體無毒的N-乙酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖。殼聚糖支架表面可形成大量微小的孔隙，可顯著提高細胞粘附[13]，為細胞生長提供一個三維立體培養的生長環境，而不是單純注射移植后所呈現的單層或漂浮狀態，使組織液更容易滲透到移植部位，維持細胞養分和氧氣供給，更利于移植細胞的早期存活和正常功能的發揮。實驗中筆者發現干細胞在殼聚糖支架周圍及內部大量存活，較單純移植組細胞存活更多，說明殼聚糖對脂肪干細胞有一定的保護作用。Su X等[10]提出的脂肪起源于筋膜的模型，其在筋膜組織中發現大量脂肪干細胞及脂肪前體細胞。移植后第4周脂肪干細胞逐步分化為脂肪細胞，并形成以殼聚糖干細胞混合體為核心的發生中心，此種現象在殼聚糖-ADSCs組及殼聚糖-SHH-ADSCs均有發生，據此可以認為搭載有脂肪干細胞的殼聚糖支架形成了類似于筋膜組織的脂肪發生中心。

通過特定生長因子可抑制細胞的凋亡及自噬過程，明顯減少移植細胞死亡[14]。本實驗選用的生長因子—音猬因子屬于Hh蛋白家族，對多種器官的形態發生分化起重要作用。SHH信號在血管發生中起關鍵作用。Hh信號通過血管生長因子調節血管的穩定性，SHH信號蛋白顯著增加血管生成相關因子，包括VEGF，FGF和Ang[15]。SHH有助于血管平滑肌細胞的增殖[16]。SHH途徑刺激促進血管生成因子的分泌，如激活素A、血管生成素、血管生成素1、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、基質金屬甲縮肽酶-9和尿激酶型纖溶酶原激活物，可以在體外和體內增強間充質干細胞的促血管生成能力[17]。SHH可直接作用于內皮細胞或刺激血管支持細胞產生無關生長因子，在血管瘤中高表達[18]。SHH作用于皮膚脂肪生成所必需的前脂肪，在缺乏SHH的皮膚中，關鍵的脂肪形成基因Pparg被下調[19]。免疫組化結果顯示第1周實驗組分化出大量新生血管內皮細胞，分布廣泛均勻，第8周實驗組已形成大量單層內皮新生血管組織，各組血管內皮細胞數量之間比較差異均有統計學意義。其促進了脂肪細胞生長，顯著提高了移植細胞部位的新生血管數量，提供了充足的血供，為移植細胞長期生存、功能的發揮提供了保障。

本實驗結果表明ADSCs-SHH-殼聚糖支架移植在增加細胞存活率，促進血管新生均具有顯著作用。其原因可能為：殼聚糖支架提供了良好的細胞生長微環境，促進了ADSCs存活分化和正常功能的發揮。SHH能促進血管新生，從而減緩凋亡、壞死及退行性變性，促進干細胞增殖，殼聚糖支架與SHH可以分別在移植早期和晚期保證移植細胞的供血供氧，其聯合作用為細胞的存活及功能發揮提供了有利條件。

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[收稿日期]2018-08-24 [修回日期]2018-09-20

編輯/賈敏