CD100在正常皮膚、急性創面及慢性創面中的表達研究

劉蓓 王芳 陳琳 余州 宋雅娟 王彤 蘇映軍

[摘要]目的：研究CD100分子在正常皮膚組織、急性創面及慢性創面中的表達。方法：采用免疫組化法檢測外科手術切除的20例正常皮膚組織、30例急性創面及20例慢性創面邊緣全層皮膚組織CD100的表達水平。結果：正常皮膚CD100主要表達于表皮，其中胞膜高表達，真皮不表達；急性創面中表皮CD100膜表達水平顯著降低；慢性創面中CD100在表皮組織低表達而真皮表達顯著升高。各組間表皮胞膜、胞質及真皮中CD100表達水平比較，差異有統計學意義（P<0.05）。結論：在皮膚組織損傷早期，表皮組織膜型CD100的脫落可能對創面愈合早期發揮重要作用，慢性創面CD100表皮持續性低表達、真皮高表達的狀態可能和創面難愈有關。

[關鍵詞]創面愈合；CD100；免疫組織化學法；急性創面；慢性創面

[中圖分類號]R64 [文獻標志碼]A [文章編號]1008-6455（2018）10-0133-04

Abstract： Objective To investigate the expression of CD100 in normal skin tissue， acute wound and chronic wound tissues. Methods Immunohistochemical method was used to detect the expression of CD100 in 20 cases of normal skin tissues， 30 cases of acute wound and 20 cases of chronic wound tissues. Results The expression of CD100 in normal skin tissues was mainly expressed in the epidermis， and was not expressed in dermis. The expression level of membrane CD100 of epidermis in acute wound was significantly reduced. In the chronic wound， the expression level of CD100 in the epidermis was low， but the expression level in the dermis was increased significantly. The expression levels of CD100 in membrane and cytoplasm of epidermal and in dermis had statistical difference in the three groups （P<0.05）. Conclusion In the early skin tissue damage， shedding of membrane CD100 in epidermis may play an important role in acute wound healing. In chronic wounds， the condition of low CD100 expression in epidermis and the high CD100 expression in epidermis may be related to the difficulty of chronic wound healing.

Key words： wound healing； CD100； immunohistochemical method； acute wound； chronic wound

慢性難愈性創面，簡稱慢性創面，指臨床治療4～6周以上仍難以愈合或不愈合的創面。臨床上常由糖尿病、靜脈曲張、動脈硬化、動脈炎、神經系統疾病等所引起。在我國，伴隨著人口逐步老齡化，糖尿病、下肢靜脈潰瘍、褥瘡等疾病的發病率逐年上升，慢性創面的發生率越來越高，是目前外科臨床工作中經常遇到的一個難題[1-2]。皮膚創傷愈合的病理生理過程非常復雜有序，涉及多種細胞、細胞外基質、生長因子和細胞因子的參與，構成復雜的調控網絡，這些創面愈合的調控因素一旦表達異常或功能受損，就會造成創面不能按時相規律有序地進行組織學修復，從而引起創面經久不愈。因此，進一步闡明急、慢性創面愈合的分子機制對于慢性創面的治療具有重要的意義。CD100（Semaphorin4D）屬于腦信號蛋白（Semaphorin）家族中的一員，在神經系統和免疫系統中高表達[3]。CD100發揮多種生物學功能，包括神經細胞軸突導向、調節免疫反應、促進腫瘤細胞血管生成等[3-6]。體外實驗和動物實驗表明，CD100能夠調節多種皮膚細胞功能，包括促進內皮細胞骨架重排、上皮細胞上皮化，樹突狀細胞的成熟等，CD100-/-小鼠較野生型小鼠相比創面愈合時間顯著延遲。而截止目前，還未有CD100與人皮膚組織創面愈合關系的臨床研究。在人皮膚組織創面愈合過程CD100的表達情況如何，在急性創面與慢性創面中CD100的表達格局是否有所差異，這種差異表達是否與創面難愈有關？為了回答上述問題，本研究選取臨床急性創面、慢性創面及正常組織標本，用免疫組化染色的方法分析CD100分子在上述不同類型皮膚組織中的表達差異，為闡明CD100參與創面愈合過程的作用提供理論及實驗依據。

1 材料和方法

1.1 臨床組織標本

1.1.1 臨床樣本來源及一般資料：本實驗所用標本均取自2015年7月-2017年7月就診于西京醫院整形外科門診及住院患者外科手術切取的廢棄組織。研究內容及研究方案獲得西京醫院倫理委員會的批準，并取得了患者或其監護人的知情同意書。

急性創面患者均為急診外傷清創縫合的患者。排除標準：各種病因引起的慢性難愈性創面、嚴重感染創面、皮膚病及器質性病變患者。共30例，男16例，女14例；平均年齡23（7～51）歲；患處分別為頭面部21例，肩部4例，下肢5例；致傷時間：1～9h，平均4h。

慢性創面患者：臨床已確診的全層皮膚組織缺失的慢性難愈性創面。排除標準：急性外傷患者、創面使用過生長因子藥物治療患者、皮膚病患者。共20例，男12例，女8例；平均年齡42（21～65）歲；分別為糖尿病足部潰瘍6例，胸腹部、下肢感染性創面6例，嚴重外傷等組織缺損創面8例。

正常對照取自整形外科手術中切取的廢棄皮膚組織，共20例，男11例，女9例；平均年齡23（1～55）歲；取樣部位為頭面部9例，四肢11例。

1.1.2 樣本的取材：所有臨床標本的獲取均在無菌手術狀態下切取，創面標本取材位置為創面邊緣全層皮膚組織，標本大小為0.5cm×0.5cm×0.3cm，切取后的標本立即浸泡于福爾馬林溶液中固定，常規石蠟包埋。

1.2 材料：兔抗人CD100單克隆抗體，購自eptomics公司；二抗和DAB顯色液購自Dako公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化染色：對組織標本進行切片，將切片在60℃恒溫箱中烘烤5h后進行脫蠟。二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ中浸泡各10min；在無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、無水乙醇Ⅲ中浸泡各10min，在95%乙醇、70%乙醇中浸泡各5min；自來水洗，磷酸鹽緩沖液PBS洗一次5min。新鮮配制枸櫞酸鈉抗原修復液，用煮沸法進行修復，修復期間用溫度計控制溫度為95℃～98℃，修復時間為20min。待恢復到室溫后，2% H2O2/甲醇溶液中浸泡15min滅活內源性過氧化物酶；5% BSA/PBST溶液室溫封閉1h；滴加1：200稀釋的一抗，同時每份標本用PBS代替一抗做陰性對照。4℃過夜；第2天取出切片，室溫條件下復溫20min，PBS洗10min；孵育二抗，室溫靜置1h；PBST洗3次，每次各10min；使用新鮮配置的DAB顯色試劑顯色；自來水洗1min；蘇木素復染1min，自來水洗1min，1%鹽酸乙醇分化30s，自來水洗反藍15min；脫水：95%乙醇5min，100%乙醇5min，二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ各10min，吹干；樹膠封片，鏡檢觀察。

1.3.2 免疫組化結果的判讀：使用免疫組化染色強度評分法對CD100染色后的組織切片的免疫組織化學染色進行判讀。由病理醫生在不知曉病例臨床資料的前提下進行讀片和評分，評分內容包括兩部分：免疫組化陽性著色細胞數量和著色強度。其中陽性著色細胞數量評分標準為：0%～5%記0分，6%～25%記1分，26%～50%記2分，51%～75%記3分，>75%記4分；著色強度評分標準為：無著色記0分，淡黃著色記1分，棕黃色著色記2分，棕褐色著色記3分。將兩組評分相乘即得到免疫強度評分。0分為陰性（-），1～4分為弱陽性（+），5～8分為陽性（++），9～12分為強陽性（+++）。

1.4 統計學分析：采用SPSS 13.0統計軟件進行統計學分析，計數資料采用率表示，行卡方檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

根據上文所述的免疫組化染色強度評分方法，按照分四組的方法進行統計，每組的樣本量較少，為了便于統計，將CD100陰性及弱陽性表達的標本合并為CD100低表達組，而將陽性及強陽性表達的合并為CD100高表達組。免疫組化結果顯示，CD100分子在正常皮膚組織中主要表達于表皮，其中胞膜高表達90.0%（18/20），胞質65.0%（13/20）高表達，而真皮組織中不表達。急性創面中表皮組織胞膜CD100表達水平較正常組織明顯降低，93.3%（28/30）低表達，胞質63.3%（19/30）低表達，真皮組織CD100分子低表達86.7%（26/30）。慢性創面表皮組織CD100胞膜低表達90.0%（18/20），而真皮組織CD100表達顯著升高，65.0%（13/20）高表達。由表1可知，急、慢性創面組CD100在表皮細胞膜中的表達水平顯著低于正常皮膚組織，差異有統計學意義（P<0.001）。三組間CD100在表皮細胞細胞質中的表達水平比較，差異有統計學意義（P=0.013），其中慢性創面組較正常組織組表達顯著降低（P<0.05）。慢性創面組CD100在真皮中的表達較急性創面組和正常組織組顯著升高（P<0.001）。CD100在各類型組織中的染色結果見圖1～2。

3 討論

慢性創面的病因非常復雜，涉及諸多內外因素。從宏觀上，組織絕對量不足、局部血液循環差及糖尿病等自身環境是造成創面難愈的病因[2，7]。從分子水平，某些刺激創面修復的蛋白、細胞因子表達異常或功能缺陷可能是引起創面難愈的分子機制[8]。CD100是腦信號蛋白中的一員，最初發現其具有調節神經細胞軸突導向及調節免疫反應的重要作用。諸多研究表明，CD100能夠作用于皮膚組織的多種細胞類型，影響其生物學功能。上皮細胞表達CD100的高親和力受體神經叢蛋白B1（PlexinB1），CD100結合PlexinB1后激活下游信號通路，促進角質形成細胞的遷移和增殖，加速上皮化進程[9]；內皮細胞也高表達PlexinB1，CD100能夠促進血管內皮細胞的骨架重塑、遷移及微血管腔和分支結構的形成[10-13]。血小板同時表達CD100及其受體CD72和Plexin-B1[14]，創傷引起的血管損傷后，血小板活化經金屬蛋白酶ADAM17水解膜型CD100釋放可溶型CD100（sCD100）。sCD100結合內皮細胞表面受體，誘導內皮細胞的血管生成[15]。Witherden等報道，在動物創傷愈合模型中，小鼠樹突狀上皮γδ-T表面的CD100分子對于促進創面愈合過程起關鍵作用。皮膚局部樹突狀上皮γδT細胞（dendritic epidermal γδT cells， DETCs）表達的CD100，結合受損上皮細胞表達的 Plexin-B2后，通過Erk和cofilin信號途徑使DETCs失去突起而變圓，并分泌角質形成細胞生長因子（KGF），誘導角質形成細胞增殖和遷移，恢復上皮層的完整性，促進皮膚創面愈合。CD100-/-小鼠中，創面愈合時間較野生型小鼠相比顯著延遲[16-17]。綜上所述，CD100在創面愈合的過程中發揮重要的作用。

本研究采用免疫組化法研究CD100在臨床急性創面、慢性創面及正常皮膚組織標本的表達。結果顯示，在正常皮膚組織、急性創面以及慢性創面邊緣皮膚中，CD100呈現不同的表達格局：正常皮膚組織中CD100主要表達于表皮細胞膜，真皮不表達；急性創面中表皮CD100膜表達水平與正常組織相比顯著降低。有研究證實CD100分子胞外存在蛋白水解位點，金屬蛋白酶ADAM17、MT1-MMP均可以水解CD100分子從細胞膜上釋放出來[18-19]。細胞活化時膜型CD100易于脫落釋放，形成sCD100。因此推測急性創面膜型CD100表達降低可能由于皮膚組織受損時表皮細胞活化，膜型CD100分子被蛋白酶切割而從膜表面脫落，形成sCD100，這個過程可能對創面愈合的起始發揮重要作用。而慢性創面的CD100表達特征是表皮組織低表達而真皮表達顯著升高。慢性創面的病因復雜，影響因素眾多，大都存在創面感染、局部血供不良、營養不良等共性因素；在分子水平，多種生長因子、細胞因子和趨化因子水平發生改變，引起創面修復停留在炎癥期。推測慢性創面表皮CD100表達降低的原因可能同樣是由于膜型分子的脫落釋放。而CD100廣泛表達于免疫細胞，并且在淋巴細胞活化后表達顯著上調[20]，真皮CD100表達顯著升高的原因是由于慢性創面炎性細胞浸潤較多，炎性細胞表面高表達CD100，因此真皮組織CD100表達增高。本研究組利用糖尿病小鼠建立創面模型，給創面局部給予重組表達的sCD100蛋白，能夠通過促進血管生成和減輕炎癥反應來促進創面愈合[21]。因此推測，慢性創面表皮持續性低表達CD100，不能刺激釋放sCD100致創面局部，而真皮免疫細胞高表達CD100的慢性炎癥狀態可能和創面難愈有關。

本研究的局限性在于沒有區分CD100表達的具體的細胞類型，且臨床標本的數量較少，無法進行相關性分析，后續仍需收集更多臨床標本，對CD100調節創面愈合的作用機制進行進一步深入研究。

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[收稿日期]2018-06-12 [修回日期]2018-07-13

編輯/朱婉蓉