線粒體鈣單向轉運體在匹魯卡品致癇大鼠海馬神經損傷中的作用

王亞麗， 王 翠， 余夢嫣， 連亞軍， 謝南昌

線粒體鈣單向轉運體在匹魯卡品致癇大鼠海馬神經損傷中的作用

王亞麗1， 王 翠2， 余夢嫣1， 連亞軍1， 謝南昌1

目的研究線粒體鈣單向轉運體(mitochondrial calcium uniporter，MCU)在氯化鋰-匹魯卡品(pilocarpine，PILO)癲癇大鼠模型神經損傷中的作用。方法將84只雄性SD大鼠隨機分成空白對照(CON)組、PILO組(2 h、8 h、24 h和72 h 4個亞組)、Ru360組和精胺(Spermine)組。觀察各組大鼠行為學改變，并熒光染色法測定海馬組織線粒體Ca2+濃度，TUNEL染色檢測海馬CA3區神經元凋亡，并采用Western Blot法檢測凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2、Cyt C和caspase-3表達變化。結果(1)與CON組比較，PILO組海馬神經元線粒體Ca2+濃度明顯升高，凋亡明顯增加(P<0.05)；與CON組比較，PILO組海馬Bax表達水平、線粒體Cyt C釋放及caspase-3激活明顯增多，而Bcl-2表達水平明顯減少(P<0.05)。(2)與PILO組比較，Ru360組海馬神經元線粒體Ca2+濃度明顯降低，凋亡明顯減少(P<0.05)；與PILO組比較，Ru360組海馬Bax表達水平、線粒體Cyt C釋放及caspase-3激活明顯減少，而Bcl-2表達水平明顯增多(P<0.05)。(3)與PILO組比較，Spermine組海馬神經元線粒體Ca2+濃度明顯升高，凋亡明顯增加(P<0.05)；與PILO組比較，Spermine組海馬Bax表達水平、線粒體Cyt C釋放及caspase-3激活明顯增多，而Bcl-2表達水平明顯減少(P<0.05)。結論MCU在PILO癲癇大鼠海馬神經損傷中發揮重要作用，抑制MCU可發揮對海馬神經元凋亡的保護作用，其機制可能是通過抑制線粒體介導的細胞凋亡途徑。

癲癇； 線粒體鈣單向轉運體； 線粒體鈣離子； 凋亡

癲癇是神經系統常見疾病，長期反復癲癇發作嚴重影響患者的生活質量，因此明確癲癇的發病機制及尋求新的治療靶點具有重要現實意義[1，2]。近年來研究表明細胞內鈣離子濃度的變化和鈣穩態調節機制的失調在癲癇發生過程中扮演重要角色[3，4]。線粒體是細胞內重要的鈣貯存庫，其調節的鈣離子內穩態對細胞和線粒體均具有重要意義。國內外研究證實線粒體鈣超載參與癲癇神經損傷過程，且抑制線粒體鈣離子轉運可以減輕線粒體鈣超載而發揮神經保護作用[5，6]。

近年新鑒定的線粒體鈣單向轉運體(mitochondrial calcium uniporter，MCU)在線粒體鈣離子攝取中發揮重要作用[7]，MCU定位于線粒體內膜，單體大小為40 kDa，其攝取鈣離子是一個依賴于線粒體內膜電勢、不需要額外能量、順鈣離子電化學梯度擴散的過程[8]。近年來研究發現MCU在心肌及大腦缺血再灌注損傷中發揮重要作用[9～12]，但其在癲癇神經損傷中的作用尚不清楚。

本實驗擬采用氯化鋰-匹魯卡品(pilocarpine，PILO)癲癇大鼠模型，應用MCU激動劑精胺(Spermine)與抑制劑Ru360干預，觀察其對癲癇大鼠行為學及癲癇持續狀態(status epilepticus，SE)后海馬組織神經元凋亡的影響，并進一步檢測大鼠海馬線粒體鈣離子濃度和Bcl-2、Bax、Cyt C及caspase-3等線粒體介導的凋亡相關蛋白，以明確MCU在PILO癲癇大鼠海馬神經損傷中的作用及相關機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選取84只6～8 w的健康雄性SD大鼠[河南省實驗動物中心，許可證號：SCXK(豫)2015-0004]，體重250～300 g。飼養溫度18～26 ℃，濕度40%～70%，標準飼料喂養，自由攝食水，自然光照射，換氣通風。隨機分為CON組、PILO組、Ru360組、Spermine組4組，其中PILO組又分為SE 2 h、8 h、24 h及72 h 4個亞組。CON組、Ru360組、Spermine組及PILO各亞組均為12只大鼠。

1.1.2 實驗試劑 氯化鋰及匹魯卡品購自USA Sigma公司。兔抗大鼠Bax、Bcl-2、Cyt C及cleaved caspase-3多克隆抗體購于UK Abcam公司，Ru360、Spermine購自USA Santa Cruz公司。BCA蛋白濃度測定試劑盒，全蛋白、線粒體蛋白及胞漿蛋白提取試劑盒購自南京建成生物科技有限公司。TUNEL試劑盒購自德國Roche公司。組織線粒體分離試劑盒購自上海杰美基因醫藥科技有限公司。鈣離子熒光探針Fluo-3，AM購于AAT Bioquest。

1.2 方法

1.2.1 癲癇模型及藥物干預模型建立 84只SD大鼠均予以氯化鋰(127 mg/kg)腹腔注射預處理，20 h后予以氫溴酸東莨菪堿(1 mg/kg)腹腔注射，30 min后予PILO(30 mg/kg)腹腔注射，CON組用等體積的0.9%Nacl溶液代替PILO。Ru360組及Spermine組在PILO注射前20 min分別給予Ru360 50 nmol/kg(即27.54 μg/kg)及Spermine 5 mg/kg腹腔注射。在SE 1 h后予以地西泮(10 mg/kg)腹腔注射終止發作。

1.2.2 癲癇發作觀察與判定 采用Racine分級法[13]評估各組SD大鼠的行為學表現，其分為6級：0 級～Ⅴ級。大鼠出現前肢陣攣、后肢直立或跌倒伴全身強直陣攣發作等Ⅳ～Ⅴ級發作時造模成功。

1.2.3 取材 CON組、PILO組、Ru360組及Spermine組在注射地西泮后72 h各取6只大鼠，分別予以水合氯醛(100 mg/kg)腹腔注射，麻醉成功后將大鼠仰臥位固定于動物解剖操作板，打開胸腔，暴露心臟，輸液針穿刺進左心室，固定針避免滑動，剪開右心耳，先灌注200～250 ml的0.9%Nacl溶液，然后緩慢灌注200～250 ml的4%多聚甲醛。灌注成功后開顱取腦，使用4%多聚甲醛浸泡固定，在4 ℃冰箱放置24 h后用于TUNEL染色。PILO組各亞組分別在注射地西泮后2 h、8 h、24 h及72 h 各取6只大鼠，Ru360組、Spermine組及CON組在注射地西泮24 h后各取6只大鼠，予以水合氯醛(300 mg/kg)麻醉處死，快速剝取腦組織，冰上分離雙側海馬，凍存于液氮用于線粒體Ca2+濃度檢測及Western Blot檢測。

1.2.4 線粒體Ca2+濃度檢測 采用差速離心法提取海馬組織線粒體。取出海馬組織，玻璃勻漿器勻漿，按組織線粒體分離試劑盒說明提取線粒體，冰上操作完成。用線粒體保存液混懸所得線粒體，用 BCA蛋白定量試劑盒測定線粒體蛋白濃度。

采用熒光染色法測定線粒體Ca2+濃度。用D-Hank’s液將線粒體沖洗3次，加入探針Fluo-3，AM后放入37 ℃孵育箱孵育30 min，D-Hank’s液沖洗掉多余探針溶劑，于37 ℃孵育30 min。使用多功能酶標分析儀測定熒光強度。激發波長為506 nm，發射波長為526 nm，整個過程避光。

1.2.5 TUNEL檢測 取出固定后的大腦，于視交叉和視乳頭間切取約3 mm厚的海馬組織，進行脫水及石蠟包埋，以每層10 μm的厚度連續冠狀切片。按TUNEL試劑盒說明書進行操作，顯微鏡下觀察海馬CA3區的細胞凋亡。

1.2.6 Western Blot檢測 取出各組凍存的海馬組織，分別提取全蛋白、胞漿蛋白和線粒體蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。電泳、轉膜后用5%的脫脂奶粉封閉2 h。洗膜3次后一抗孵育，兔抗大鼠Cty C(線粒體蛋白、胞漿蛋白，按1∶1000稀釋)、Bax(1∶1000)、Bcl-2(1∶1000)、cleaved caspase-3(1∶500)多克隆抗體，4 ℃冰箱過夜。洗膜3次后加入二抗山羊抗兔IgG(1∶8000)，室溫孵育1.5 h，洗膜3次，顯影成像。凝膠成像分析系統測定條帶光密度，目的蛋白的相對表達量用目的蛋白與內參(Cox-Ⅳ、Actin)條帶光密度的比值來表示。

2 結 果

2.1 行為學觀察 CON組大鼠行為無異常，PILO組、Ru360組及Spermine組大鼠在腹腔注射氯化鋰后的20 h，均無行為學異常。注射PILO后3組大鼠均出現重復刻板動作、毛發豎立等周圍膽堿能反應，3組大鼠均在5～30 min后出現Racine Ⅰ級發作，11～60 min后出現Ⅳ級或Ⅴ級發作，并出現SE。3組大鼠發作潛伏期無統計學差異(P<0.05)(見表1)。

表1 各組致癇發作潛伏期比較

注：其差異無統計學意義P>0.05

2.2 各組大鼠海馬組織中線粒體Ca2+濃度 與CON組對比，PILO癲癇大鼠海馬線粒體Ca2+濃度明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。與PILO組對比，Ru360顯著降低海馬線粒體Ca2+濃度，而Spermine顯著升高海馬線粒體Ca2+濃度，差異有統計學意義(P<0.05)(見圖1)。

2.3 TUNEL法檢測海馬CA3區神經元凋亡 CON組僅見1～2個TUNEL陽性細胞，而PILO組可見大量TUNEL陽性細胞。與PILO組比較，Ru360顯著減少癲癇誘發的海馬神經元凋亡，Spermine則顯著增加癲癇誘發的海馬神經元凋亡，差異有統計學意義(P<0.05)(見圖2、表2)。

表2 各組海馬CA3區凋亡細胞數

與CON組比較*P<0.05；與PILO組比較#P<0.05

2.4 各組大鼠海馬組織中Bax和Bcl-2表達變化 與CON組比較，PILO組海馬Bax表達水平明顯增多，Bcl-2表達水平明顯減少，差異有統計學意義(P<0.05)。與PILO組比較，Ru360顯著降低海馬組織Bax表達水平，增加Bcl-2表達水平，而Spermine則顯著增加海馬組織Bax表達水平，降低Bcl-2表達水平，差異有統計學意義(P<0.05)(見圖3)。

2.5 各組大鼠海馬組織中Cyt C釋放和caspase-3激活 與CON組比較，PILO組海馬神經元線粒體Cyt C釋放和caspase-3的激活顯著增加，差異有統計學意義(P<0.05)。與PILO組比較，Ru360顯著抑制海馬神經元線粒體Cyt C釋放及caspase-3激活，而Spermine則顯著增加海馬神經元線粒體Cyt C釋放及caspase-3激活，差異有統計學意義(P<0.05)(見圖4)。

圖1 各組大鼠海馬線粒體鈣離子濃度比較(與CON組比較*P<0.05；與PILO組比較#P<0.05)

圖2 各組大鼠海馬CA3區凋亡檢測(TUNEL，×400)。A：Control組；B：PILO組；C：Ru360組；D：Spermine組

圖3 各組大鼠海馬組織Bax、Bcl-2表達水平(與CON組比較*P<0.05；與PILO組比較#P<0.05)

A：各組線粒體Cyt C(mito-CytC)、胞質Cyt C(cyto-CytC)表達水平；B：各組cleaved caspase-3表達水平(與CON組比較*P<0.05；與PILO組比較#P<0.05)

3 討 論

癲癇發作可使鈣離子由多種途徑涌入細胞內，而線粒體通過攝取胞漿中過多的鈣離子，降低胞漿中鈣離子濃度，發揮代償作用。但線粒體鈣離子超載也使線粒體跨膜電位下降及通透性增加，Cyt C釋放等，從而引起細胞凋亡和壞死，導致神經元對癇性損傷更加敏感，形成惡性循環[14，15]。MCU在線粒體鈣離子攝取中發揮重要作用，是鈣離子由胞漿進入線粒體基質的主要通路[7]。近年研究發現在 NMDA誘導體外培養海馬及皮質神經元的興奮性毒性損傷過程中，高表達 MCU 導致線粒體鈣離子濃度升高，增加興奮毒性神經元死亡，而降低 MCU 表達使線粒體鈣離子濃度降低，減少興奮毒性神經元死亡[16]。本研究結果顯示，與對照組相比，PILO誘導的癲癇大鼠海馬線粒體Ca2+濃度顯著增加，且在SE 2 h達峰值，海馬神經元凋亡明顯增加，MCU抑制劑Ru360可通過緩解線粒體鈣離子超載，顯著減輕海馬神經元凋亡，而MCU激動劑精胺則加重線粒體鈣離子超載，顯著增加海馬神經元凋亡。本研究表明，MCU調控的線粒體鈣通道可能在癲癇大鼠海馬神經元凋亡中發揮重要作用。

Bcl-2家族蛋白分為促進凋亡的Bax亞族(Bax、Bak等)和抑制凋亡的Bcl-2亞族(Bcl-2、Bcl-xl等)[17]，在細胞凋亡過程中發揮重要作用，是線粒體凋亡途徑的關鍵[18，19]。研究發現Bcl-2蛋白可通過改變線粒體膜通透性轉運孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)的開放和線粒體內Cyt C、AIF等促凋亡因子的釋放來調節凋亡過程，Bcl-2蛋白過表達可減少mPTP開放、Cyt C及AIF釋放，發揮抗凋亡作用，Bax蛋白過表達可導致線粒體跨膜電位丟失、Cyt C及AIF釋放，引起細胞凋亡[20]。本研究結果顯示，與CON組相比，PILO癲癇大鼠海馬組織Bax蛋白表達水平明顯增加，而Bcl-2蛋白表達水平明顯減少。與PILO組相比，Ru360顯著降低海馬組織Bax蛋白表達水平，并且增加Bcl-2蛋白表達；而精胺則顯著增加Bax蛋白表達，并降低Bcl-2蛋白表達。本研究證實MCU可能通過調控Bcl-2和Bax蛋白表達，從而在癲癇海馬神經元凋亡中發揮重要作用。

線粒體鈣離子含量影響線粒體膜的功能結構，正常情況下線粒體膜可阻止線粒體內物質的釋放，而癲癇發作使線粒體鈣離子超載，引起mPTP呈高開放狀態[21～23]，導致線粒體膜電位下降，位于線粒體內膜的Cyt C、AIF等促凋亡蛋白通過開放的mPTP從線粒體膜間隙釋放入胞質和細胞核內，最終激活下游的凋亡執行蛋白酶caspase-3，導致DNA斷裂，核染色質凝聚，引起細胞凋亡[24]。本研究結果顯示：與CON組比較，PILO癲癇大鼠海馬線粒體Cyt C釋放及caspase-3激活均顯著增加，Ru360可明顯抑制線粒體Cyt C釋放和caspase-3活化，而精胺則增加線粒體Cyt C釋放和caspase-3活化。本研究證實MCU可能通過調控線粒體介導的細胞凋亡通路，從而在癲癇海馬神經元凋亡中發揮重要作用。

綜上所述，MCU在PILO癲癇大鼠海馬神經損傷中發揮重要作用，抑制MCU可顯著緩解癲癇海馬神經元凋亡，其機制可能為通過抑制線粒體介導的細胞凋亡途徑，為抗癲癇治療提供了新思路。

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Effectofmitochondrialcalciumuniporteronhippocampalneuronaldamageinpilocarpine-inducedseizures

WANGYali，WANGCui，YUMengyan，etal.

(DepartmentofNeurologyofFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity，Zhengzhou450000，China)

ObjectiveTo investigate the effect of mitochondrial calcium uniporter (MCU) on hippocampal neuronal damage in pilocarpine-induced seizures.Methods84 male SD rats were randomly divided into 4 groups：control group，PILO group (divided into 4 subgroups：2 h，8 h，24 h and 72 h)，Ru360 group and Spermine group. The behavioral changes of each group were observed. Fluorescent staining was used to detect the free calcium concentration of hippocampus mitochondria and hippocampal neuronal apoptosis was detected by TUNEL staining. The expressions of Bax，Bcl-2，Cyt C and caspase-3 were detected by Western blotting.Results(1)Compared with control group，the mitochondrial calcium concentration and apoptotic neurons in PILO group increased (P<0.05). Compared with control group，expression of Bax，caspase-3 activation and Cyt C release in PILO group increased，while expression of Bcl-2 decreased (P<0.05). (2)Compared with PILO group，Ru360 reduced the mitochondrial calcium concentration and apoptotic neurons (P<0.05). Compared with PILO group，Ru360 reduced expression of Bax，caspase-3 activation and Cyt C release，while increased expression of Bcl-2 (P<0.05). (3)Compared with PILO group，Spermine increased the mitochondrial calcium concentration and apoptotic neurons (P<0.05). Compared with PILO group，Spermine increased expression of Bax，caspase-3 activation and Cyt C release，while reduced expression of Bcl-2 (P<0.05).ConclusionMCU plays an important role in hippocampal neuronal damage in pilocarpine-induced seizures. Inhibition of MCU can significantly attenuate hippocampal neuronal apoptosis，and the underlying mechanism maybe through mitochondria-mediated apoptosis pathway.

Epilepsy； Mitochondrial calcium uniporter； Mitochondrial calcium； Apoptosis

1003-2754(2017)11-0964-05

2017-09-10；

2017-10-15

國家自然科學基金面上項目(No. 81571260)

(1.鄭州大學第一附屬醫院神經內科，河南 鄭州 450000；2.鄭州大學第一附屬醫院檢驗科，河南 鄭州 450000)

謝南昌，E-mail：xielanbor@163.com

R742.1

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