骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠的Iba1、IL-1β和IL-10影響

項(xiàng)正兵， 曾 紅， 柴 文， 屈新輝， 曹文鋒， 吳曉牧， 謝旭芳

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠的Iba1、IL-1β和IL-10影響

項(xiàng)正兵， 曾 紅， 柴 文， 屈新輝， 曹文鋒， 吳曉牧， 謝旭芳

目的探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)小鼠的小膠質(zhì)細(xì)胞Iba1、IL-1β和IL-10表達(dá)的影響。方法以髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白多肽35-55(MOG 35-55)免疫誘導(dǎo)C57BL/6雌性小鼠制備EAE小鼠模型。將30只雌性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為3組：BMMSCs移植組、EAE組和正常組。采用免疫組化檢測(cè)腦和脊髓的Iba1(離子鈣結(jié)合銜接分子1)、IL-1β和IL-10的表達(dá)。結(jié)果BMMSCs移植組神經(jīng)功能缺損癥狀要輕于EAE組，BMMSCs移植組腦和脊髓的Iba1和IL-1β表達(dá)水平低于EAE組(P<0.05)，而B(niǎo)MMSCs移植組腦和脊髓的IL-10表達(dá)水平高于EAE組(P<0.05)。結(jié)論BMMSCs能改善EAE小鼠的癥狀，其作用機(jī)制之一可能是抑制了小膠質(zhì)細(xì)胞的激活、抑制炎癥因子IL-1β及促進(jìn)抗炎因子IL-10的表達(dá)。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞； 實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎； 多發(fā)性硬化； Iba1； IL-1β； IL-10

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)自身免疫性炎性脫髓鞘疾病。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)具有與人類MS相同的臨床特征、免疫及病理特征，是目前國(guó)際公認(rèn)的研究MS的理想動(dòng)物模型。小膠質(zhì)細(xì)胞是CNS重要的組成成分，被認(rèn)為是CNS固有的免疫細(xì)胞，在正常情況下處于靜息狀態(tài)，而在病理情況下，小膠質(zhì)細(xì)胞可被激活活化為具有免疫功能的免疫細(xì)胞，已有研究表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)能抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖、吞噬功能及活化并能改善腦卒中、阿爾茨海默病(AD)動(dòng)物模型的神經(jīng)功能。其中機(jī)制可能是BMMSCs可使小膠質(zhì)細(xì)胞從釋放促炎因子的M1表型轉(zhuǎn)化為神經(jīng)保護(hù)及具有吞噬活性M2表型轉(zhuǎn)化。但目前為止，在EAE的體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)中BMMSCs促使小膠質(zhì)細(xì)胞從M1表型向M2表型轉(zhuǎn)化的相關(guān)研究非常少見(jiàn)。

本研究擬用BMMSCs移植治療EAE小鼠模型，通過(guò)免疫組化法檢測(cè)移植后的EAE小鼠小膠質(zhì)激活的標(biāo)志物Iba1，及炎癥因子IL-1β和抗炎因子IL-10的表達(dá)情況，探討B(tài)MMSCs治療MS的新切入點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2～3 w的健康雄性、雌性 SPF(Specific Pathogen Free)級(jí)C57BL/6小鼠各60只，體重15～20 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。飼養(yǎng)于江西省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 主要試劑 MOG35-55(Met-Glu-Val-Gly-Trp-Tyr-Arg-Ser-Pro-Phe-Ser-Arg-Val-Val-His-Leu-Tyr-Arg-Asn-Gly-Lys)由西安聯(lián)美生物科技有限公司合成，純度>95%。百日咳毒素(PTX)、完全弗氏佐劑(CFA)均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。Iba1抗體購(gòu)自abcam公司。IL-10 和 IL-1β抗體均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。SP法免疫組化試劑盒及山羊血清封閉液購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。DAB顯色盒均購(gòu)自北京中杉金橋公司。

1.3 方法

1.3.1 BMMSCs分離、培養(yǎng)、體外擴(kuò)增 2～4 w齡的雄性C57BL/6小鼠在麻醉后經(jīng)頸椎脫臼法被處死，75%酒精浸泡消毒8min后置于超凈臺(tái)無(wú)菌托盤(pán)中。剪開(kāi)股骨皮膚后無(wú)菌鈍性分離局部肌肉，快速取出股骨，無(wú)菌眼科剪剪去股骨兩端近干骺部分，用含10%FBS的DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基的5 ml注射器刺入骨髓腔，沖洗骨髓腔至股骨變白，收集沖洗液，接種于75 cm2培養(yǎng)瓶，于5%CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后半量換液去除懸浮細(xì)胞和污物，此后每48 h～72 h全量換液1次，每天于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。原代培養(yǎng)8～9 d后細(xì)胞融合率達(dá)80%～90%，加入0.25%含EDTA的胰酶消化，以1∶2比例傳代。此后每隔3～5 d傳代一次。傳代至第3～4代。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好、融合至90%時(shí)，用0.25%含EDTA的胰酶消化，離心收集，PBS重懸后行細(xì)胞計(jì)數(shù)。將收集的BMMSC以PBS稀釋成1.0×106/0.3 ml備用。

1.3.2 BMMSCs的流式鑒定 取傳代培養(yǎng)第3代的BMMSCs，調(diào)整細(xì)胞密度為3.0×106/ml。取100 μl細(xì)胞懸液于加入標(biāo)識(shí)的2 ml Ep管內(nèi)，分別加入2 μl FITC anti-mouse/rat CD29、FITC anti-mouse/rat CD90、PE anti-mouse CD34、PE anti-rat CD45，小心吹打混勻后4 ℃避光孵育30 min，然后分別加入1.5 ml Buffer溶液，小心吹打混勻后離心4 min，吸去上清液，再加入400 μl Buffer溶液，重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。

1.3.3 EAE動(dòng)物模型制備 將200 μg 人工合成 MOG35-55多肽溶于200 μl的0.01 mol/L PBS緩沖液，再與等量含4 mg/ml熱滅活人結(jié)核桿菌的CFA充分在真空混合針中往返混勻，制備過(guò)程30 min，抽打混勻至油包水狀的白色不透明的乳劑，制備成完全性抗原。隨機(jī)將6～8 w齡的雌性C57BL/6小鼠分為BMMSCs移植組、EAE組和正常組，每組10只。BMMSCs移植組和EAE組于小鼠雙側(cè)背部脊椎旁分4點(diǎn)皮下注射制備好的MOG35-55乳劑抗原，0.2 ml/只。正常組用生理鹽水代替MOG35-55，余步驟和方法同前。免疫當(dāng)天計(jì)為0 d，分別于0、2 d給每只小鼠腹腔注射百日咳毒素200 ng/次。

1.3.4 BMMSCs移植EAE動(dòng)物模型 BMMSCs移植組在免疫后第3 d通過(guò)尾靜脈注射傳代第3代1.0×106BMMSCs/只。EAE組和正常組均以尾靜脈注射等體積PBS。

1.3.5 神經(jīng)功能評(píng)分 自免疫當(dāng)天開(kāi)始，分別于每日上午觀察小鼠的精神狀態(tài)、活動(dòng)狀況及稱重測(cè)量，并按照6分法神經(jīng)功能評(píng)分法進(jìn)行評(píng)分并記錄。0分：無(wú)明顯疾病癥狀；0.5分：部分尾巴無(wú)力；1.0分：尾巴完全癱瘓，整個(gè)尾巴完全變軟，完全無(wú)力；2.0分：雙后肢無(wú)力，步態(tài)蹣跚；2.5分：后肢部分癱瘓，單后肢完全癱瘓；3.0分：雙后肢完全癱瘓，被動(dòng)翻身不能自行恢復(fù)；3.5分：雙后肢完全癱瘓，前肢部分癱瘓；4.0分：四肢完全癱瘓；5.0分：瀕死狀態(tài)；6分：死亡。

1.3.6 解剖及病理染色 免疫后30 d，麻醉小鼠后，經(jīng)左心室插管灌注生理鹽水，繼以4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液灌注，待灌注充分后解剖分離大腦和脊髓，將大腦和脊髓浸泡在4 ℃ 4%多聚甲醛中固定24 h，逐級(jí)予乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，切片行HE染色。經(jīng)脫蠟、脫水、蘇木素染色、伊紅液染色、封片后，置于200×光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3.7 免疫組化 選擇上述蠟塊行4～6 μm厚切片，經(jīng)脫蠟、脫水、抗原修復(fù)、山羊血清封閉后，加入抗Iba1(1：500)、IL-10(1：200)和 IL-1β(1∶200)的一抗，4 ℃孵育過(guò)夜。復(fù)溫后分別加山羊抗兔 IgG二抗，辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，經(jīng)DAB顯色后在光學(xué)顯微鏡下觀察。陰性對(duì)照除以磷酸鹽緩沖液液代替一抗外，余步驟相同。陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。選取病灶周邊的5個(gè)隨機(jī)視野(40×10倍)，用Image pro-plus 6.0軟件處理分析采集的免疫組化圖片中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及免疫組化圖片求其平均光密度值(AOD)，每只小鼠腦脊髓組織取以下各項(xiàng)指標(biāo)均重復(fù)做3張切片，并取其平均值作統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié) 果

2.1 BMMSCs培養(yǎng)擴(kuò)增結(jié)果 BMMSCs接種于塑料培養(yǎng)瓶中24 h內(nèi)呈單個(gè)核細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)，24 h后可見(jiàn)少量圓形貼壁細(xì)胞，48 h后貼壁細(xì)胞逐漸增多，呈集落式貼壁生長(zhǎng)，由中心向四周呈放射狀排列，且可見(jiàn)大量的懸浮細(xì)胞，隨著換液傳代，大部分懸浮細(xì)胞被去除，BMMSCs得以純化，細(xì)胞形態(tài)多為不規(guī)則長(zhǎng)梭形。

2.2 BMMSCs的流式鑒定結(jié)果 取傳代培養(yǎng)第3代的BMMSCs，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)鑒定，CD90和CD29的表達(dá)率分別為91.70%和88.00%，CD34、CD45的表達(dá)率分別為2.70%、5.65%。

2.3 各組神經(jīng)功能評(píng)分比較 BMMSCs移植組、EAE組的小鼠全部發(fā)病，兩組小鼠均在免疫6 d后開(kāi)始陸續(xù)發(fā)病，出現(xiàn)鼠尾張力下降、肢體癱瘓，癥狀隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸加重，高峰期后有一定的緩解。而在峰值評(píng)分(16 d)和慢性期(28 d)評(píng)分，BMMSCs移植組神經(jīng)功能評(píng)分均明顯低于EAE組(P<0.05)。正常組均無(wú)一只發(fā)病。

2.4 HE染色結(jié)果 正常組未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。EAE組小鼠腦和脊髓切片均有不同程度的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，多在血管周圍或白質(zhì)部分見(jiàn)到簇狀炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，相對(duì)于EAE組，BMMSCs移植組小鼠的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕(見(jiàn)圖2)。

2.5 各組小鼠腦和脊髓的Iba1表達(dá)的比較 BMSCs移植組和EAE組腦和脊髓的Iba1的表達(dá)均高于正常組(P<0.05)。BMSCs移植組腦和脊髓Iba1的表達(dá)要明顯低于EAE組(P<0.05)。(見(jiàn)表2、圖3)。

2.6 各組小鼠腦和脊髓的IL-1β表達(dá)的比較 BMSCs移植組和EAE組腦和脊髓的IL-1β的表達(dá)均高于正常組(P<0.05)。BMSCs移植組腦和脊髓IL-1β的表達(dá)要明顯低于EAE組(P<0.05)。(見(jiàn)表2、圖4)。

2.7 各組小鼠腦和脊髓的IL-10表達(dá)的比較 BMSCs移植組和EAE組腦和脊髓的IL-10的表達(dá)均高于正常組(P<0.05)。BMSCs移植組腦和脊髓IL-10的表達(dá)高于EAE組(P<0.05)。(見(jiàn)表2、圖5)。

表1 神經(jīng)功能評(píng)分比較

注：與EAE組比較★P<0.05

表2 各組腦脊髓Iba1，IL-1β和IL-10的表達(dá)比較

注：與EAE組比較★P<0.05；與正常組比較▲P<0.05

圖1 BMMSCs流式鑒定圖：高表達(dá)CD90(91.70%)和CD29(88.00%)；低表達(dá)CD34(2.70%)和CD45(5.65%)

圖2 A：正常對(duì)照組 B：EAE組 C：BMSCs移植組(HE染色×400)

圖3 A：正常組，B：EAE組，C：BMSCs移植組( Iba1 免疫組化×400)

圖4 A：正常組，B：EAE組，C：BMSCs移植組( IL-1β 免疫組化×400)

圖5 A：正常組，B：EAE組，C：BMSCs移植組( IL-10 免疫組化×400)

3 討 論

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)自身免疫性炎性脫髓鞘疾病，常累及大腦白質(zhì)和脊髓，是導(dǎo)致青中年人運(yùn)動(dòng)障礙最常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)具有與人類MS相同的臨床特征、免疫及病理特征，是目前國(guó)際公認(rèn)的研究MS的理想動(dòng)物模型。MS發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，目前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為MS和EAE發(fā)病機(jī)制是由自身反應(yīng)性T、B細(xì)胞介導(dǎo)的直接針對(duì)髓鞘抗原的自身免疫反應(yīng)所致[1]。

小膠質(zhì)細(xì)胞是CNS重要的組成成分，被認(rèn)為是CNS固有的免疫細(xì)胞，在正常情況下處于靜息狀態(tài)，而在損傷或感染的情況下，小膠質(zhì)細(xì)胞可被激活活化為具有免疫功能的免疫細(xì)胞，有幾個(gè)標(biāo)記物上調(diào)，包括離子鈣結(jié)合銜接分子 1(Iba1)、CD11b和 Mac-1[2～4]。有學(xué)者認(rèn)為小膠質(zhì)細(xì)胞活化主要是通過(guò)“經(jīng)典”激活途徑和“替代”激活途徑激活并表達(dá)不同的亞型[5]?！敖?jīng)典”途徑激活的小膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)出M1(促炎癥)型，而“替代”激活途徑激活的小膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)出M2(抗炎癥)型。“經(jīng)典”激活途徑是由γ干擾素(interferon，IFN-γ) 和白細(xì)胞介素-17(Interleukin-17，IL-17)介導(dǎo)的[6，7]，高表達(dá) M1 型特征的炎癥因子(IL-1β、TNF-α、IL-12、IL-6、IFN-γ、MHC-II和NO等)，低表達(dá) M2 型特征的抗炎因子(IL-10，IL-4 等)。而“替代”激活途徑是由IL-4和IL-13介導(dǎo)的[8]。

有研究表明CNS小膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)度激活在 EAE/MS 發(fā)病中起著非常重要的作用[9]。Bhasin 等[10]發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活時(shí)間與EAE小鼠的發(fā)病程度明顯相關(guān)，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活，可減輕EAE小鼠的臨床癥狀。2014年Yin等[11]在MOG35-55誘導(dǎo)C57BL/6小鼠制作的EAE模型中，發(fā)現(xiàn)適量的百日咳毒素能通過(guò)對(duì)活化小膠質(zhì)細(xì)胞的抑制，減輕EAE的脫髓鞘病理改變，并能減輕神經(jīng)功能缺失。Eitas等[12]研究發(fā)現(xiàn)核苷酸結(jié)合富含亮氨酸重復(fù)序列家族成員NLRX1(Nucleotide-binding Leucine-rich Repeat (NLR) Family Member，NLRX1)能顯著改善EAE的神經(jīng)功能評(píng)分，其機(jī)制與減輕了小膠質(zhì)細(xì)胞的激活有關(guān)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)具有易獲得性，是目前干細(xì)胞移植研究領(lǐng)域使用最廣泛的干細(xì)胞。已有少量體內(nèi)外研究表明BMMSCs能抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖、吞噬功能及活化[13，14]并能改善腦卒中、阿爾茨海默病(AD)動(dòng)物模型的神經(jīng)功能。如Yan等[15]研究用脂多糖(LPS)誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞活化，實(shí)驗(yàn)中將BMMSCs與LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)MMSC能抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖，并抑制其吞噬功能，同時(shí)可明顯抑制小膠質(zhì)細(xì)胞多種炎癥因子及化學(xué)因子的分泌，如TNF-α、IL-1β，IL-6，IL-12，MCP-1。也有研究表明BMMSCs可促使小膠質(zhì)細(xì)胞向“替代”激活表型M2型轉(zhuǎn)化，顯著上調(diào)與神經(jīng)保護(hù)表型相關(guān)的表面分子，如趨化因子CX3CL1的受體(CX3CR1)[16]，CD200受體(CD200R)[17]和孤核受體NURR1[18]。這些分子可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的神毒性炎癥表型，和逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)后的TNF、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)和氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白等促炎性分子的表達(dá)。進(jìn)一步研究表明BMMSCs是在功能水平上影響小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，經(jīng)LPS活化的小膠質(zhì)細(xì)胞，其TREM-2(髓樣細(xì)胞-2表達(dá)的觸發(fā)受體)的表達(dá)上調(diào)，使小膠質(zhì)細(xì)胞基部的鈣離子濃度及其吞噬活性顯著提高，但并不影響活化的小膠質(zhì)細(xì)胞增殖[19]。有研究通過(guò)siRNA沉默技術(shù)阻斷趨化因子CX3CL1，或干擾CX3CL1與小膠質(zhì)細(xì)胞上CX3CR1的結(jié)合的技術(shù)，發(fā)現(xiàn)BMMSCs 能使LPS激活小膠質(zhì)細(xì)胞依賴其分泌的CX3CL1從有害的表型向有利的神經(jīng)保護(hù)表型轉(zhuǎn)化[16]。這些研究表明，小膠質(zhì)細(xì)胞活化后，BMMSCs可使小膠質(zhì)細(xì)胞從釋放促炎因子的M1表型轉(zhuǎn)化為神經(jīng)保護(hù)及具有吞噬活性M2表型轉(zhuǎn)化。Xin等[20]研究在小鼠大腦中動(dòng)脈閉塞的中發(fā)現(xiàn)BMMSCs可減少缺血邊界區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞TGFβ1 的表達(dá)。然而Ma等[21]在AD的動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)大腦內(nèi)移植脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)治療的AD動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)ADSCs 能明顯減少β淀粉樣蛋白的在海馬及大腦皮質(zhì)的沉積及改善學(xué)習(xí)和記憶功能，其機(jī)制與小膠質(zhì)的活化有關(guān)。

本研究利用MOG35-55誘導(dǎo)C57BL/6小鼠制作的EAE模型中，發(fā)現(xiàn)EAE組腦和脊髓的Iba1表達(dá)水平高于正常組，提示小膠質(zhì)細(xì)胞活化在EAE發(fā)病中起著重要的作用。神經(jīng)功能評(píng)分顯示 BMMSCs移植組神經(jīng)功能缺損癥狀要輕于EAE組，BMMSCs移植組腦和脊髓的Iba1和IL-1β表達(dá)水平低于EAE組，而B(niǎo)MMSCs移植組腦和脊髓的IL-10表達(dá)水平高于EAE組。提示BMMSCs改善EAE神經(jīng)功能可能機(jī)制之一是促使小膠質(zhì)細(xì)胞從M1表型(表達(dá)IL-1β)向M2表型轉(zhuǎn)化(表達(dá)IL-10)。為BMMSCs移植治療MS提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。

[1]Compston A，Coles A. Multiple sclerosis[J]. Lancet，2008，372：1502-1517.

[2]Petersen MA，Dailey ME. Diverse microglial motility behaviors during clearance of dead cells in hippocampal slices[J]. Glia，2004，46：195-206.

[3]Kettenmann H，Hanisch UK，Noda M，et al. Physiology of microglia[J]. Physiol Rev，2011，91：461-553.

[4]Giannetti P，Politis M，Su P，et al. Microglia activation in multiple sclerosis black hole spredicts outcome in progressive patients：an in vivo[J]. Neurobiol Dis，2014，65：203-210.

[5]Kaoru S，Christopher K. Microglial cell origin and phenoypes in healh and disease[J]. Nat Immunol，2011，11：775-787.

[6]Zepp J，Wu L，Li XX. IL-17 receptor signaling and T helper 17-mediated autoimmune demyelinating disease[J]. Trends Immunol，2011，32(5)：232-239.

[7]Obermajer N，Popp FC，Soeder Y，et al. Conversion of Th17 into IL-17A(neg) regulatory T cells：a novel mechanism in prolonged allograft survival promoted by mesenchymal stem cell-supported minimized immunosuppressive therapy[J]. J Immunol，2014，193(10)：4988-4999.

[8]張俊華，鄭配國(guó)，馬雪涵，等. 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎小鼠的治療作用研究[J]. 第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，36(1)：34-38.

[9]Mikita J，Dubourdieu-Cassagno N，Deloire MS，et al. Altered M1/M2 activation patterns of monocytes in severe relapsing experimental rat model of multiple sclerosis. Amelioration of clinical status by M2 activated monocyte administration[J]. Mult Scler，2011，17(1)：2-15.

[10]Bhasin M，Wu M，Tsirka SE. Modulation of microglial/macrophage activation by macrophage inhibitory factor (TKP) or tuftsin (TKPR) attenuates the disease course of experimental autoimmune encephalomyelitis[J]. BMC Immunol，2007，8：10.

[11]Yin JX，Tang Z，Gan Y，et al. Pertussis toxin modulates microglia and T cell profile to protect experimental autoimmune encephalomyelitis[J]. Neuropharmacology，2014，81：1-5.

[12]Eitas TK，Chou WC，Wen H，et al. The Nucleotide-binding Leucine-rich Repeat (NLR) family member NLRX1 mediates protection against experimental autoimmune encephalomyelitis and represses macrophage/microglia-induced inflammation[J]. J Biol Chem，2014，289(7)：4173-4179.

[13]Kassis I，Grigoriadis N，Gowda-Kurkalli B，et al. Neuroprotection and immunomodulation with mesenchymal stem cells in chronic experimental autoimmune encephalomyelitis[J]. Arch Neurol，2008，65(6)：753-761.

[14]Gordon D，Pavlovska G，Uney JB，et al. Mesenchymal stem cells infiltrate the spinal cord，reduce demyelination，and localize to white matter lesions in experimental autoimmune encephalomyelitis[J]. J Neuropathol Exp Neurol，2010，69(11)：1087-1095.

[15]Yan K，Zhang R，Sun C，et al. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells maintain the resting phenotype of microglia and inhibit microglial activation[J]. PloS one，2013，8(12)：e84116.

[16]Giunti D，Parodi B，Usai C，et al. Mesenchymal stem cells shape microglia effector functions through the release of CX3CL1[J]. Stem Cells，2012，30(9)：2044-2053.

[17]Denieffe S，Kelly RJ，McDonald C，et al. Classical activation of microglia in CD200-deficient mice is a consequence of blood brain barrier permeability and infiltration of peripheral cells[J]. Brain Behav Immun，2013，34：86-97.

[18]Saijo K，Winner B，Carson CT，et al. A Nurr1/CoREST pathway in microglia and astrocytes protects dopaminergic neurons from inflammation-induced death[J]. Cell，2009，137：47-59.

[19]Hsieh CL，Koike M，Spusta SC，et al. A role for TREM2 ligands in the phagocytosis of apoptotic neuronal cells by microglia[J]. J Neurochem 2009，109：1144-1156.

[20]Xin H，Chopp M，Shen LH，et al. Multipotent mesenchymal stromal cells decrease transforming growth factor beta1 expression in microglia/macrophages and down-regulate plasminogen activator inhibitor 1 expression in astrocytes after stroke[J]. Neurosci Lett，2013，542：81-86.

[21]Ma T，Gong K，Ao Q，et al. Intracerebral transplantation of adipose-derived mesenchymal stem cells alternatively activates microglia and ameliorates neuropathological deficits in Alzheimer’s disease mice[J]. Cell transplantation，2013，22(Suppl 1)：S113-1126.

EffectofbonemarrowmesenchymalstemcellsonIba1，IL-1βandIL-10inmicewithexperimentalautoimmuneencephalomyelitis

XIANGZhengbing，ZENGHong，CHAIWen，etal.

(DepartmentofNeurology，thePeople’sHospitalofJiangxiProvinceJiangxiProvince，Nanchang330006，China)

ObjectiveTo explore the effect of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSCs) on Iba1，IL-10 and IL-1βin central nervous system of mice with experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE).MethodsThe EAE model was induced in mice using myelin oligodendrocyte glycoprotein peptides 35-55 (MOG 35-55). 30 female C57BL/6 mice were randomly divided into 3 groups：BMMSCs-treated group，EAE group and health group. The brain and spinal cord were collected and their expressions of Iba1，IL-1β and IL-10 were detected using immunohistochemistry.ResultsThe neurological deficit of BMMSCs-treated mice were lighter than the EAE mice (P<0.05)；the expression of Iba1 and IL-1βin central nervous system in BMMSCs treatment group were lower than in EAE group (P<0.05)，while the expression of IL-10 in central nervous system in BMMSCs treatment group were higher than in EAE group (P<0.05).ConclusionBMMSCs can ameliorate the mean clinical scores of mice with EAE through inhibiting the expression of Iba1 and IL-1β，while promoting the expression of IL-10.

Bone marrow mesenchymal stem cells； Experimental autoimmune encephalomyelitis； Multiple sclerosis； Iba1； IL-1β； IL-10

1003-2754(2017)11-0982-06

2017-07-12；

2017-09-25

江西省青年科學(xué)基金計(jì)劃(No. 20142BAB215056)；江西省衛(wèi)生計(jì)生委科技計(jì)劃(No. 20155064)

(江西省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 江西省神經(jīng)病學(xué)研究所，江西 南昌 330006)

謝旭芳，E-mail：xufxie@163.com

R744

A