不同成熟期桃品種NAC基因遺傳多樣性研究

雷雨+張雪芳+羅鑫磊+劉咲頔+熊怡+馮濤

摘要： 從11個桃品種嫩葉中分別提取基因組DNA，根據GDR數據庫中NAC基因序列信息，設計特異引物，PCR擴增，對產物克隆測序。然后，使用DNAman軟件進行核苷酸和氨基酸序列比對，使用ORF Finder獲得開放閱讀框和推導氨基酸序列，使用CDD工具進行蛋白質結構域分析，利用Blastp工具搜索同源蛋白，采用Mega軟件繪制系統進化樹。結果發現，NAC蛋白第16～140位存在1個NAC結構域，N端比較保守，C端則多樣性比較高；核苷酸變異有SNP和Indel 2類，津柳早紅和小白桃在第3外顯子區SNP和Indel變異數量非常多，說明這2個品種的NAC基因結構具有獨特性。蛋白比對發現，桃NAC與梅同源性最高，其次是鴨梨；進化樹體現了物種的親緣關系。結果表明，參試品種NAC基因存在比較豐富的遺傳多樣性，在保守區內的氨基酸變異可能影響蛋白的功能。

關鍵詞： 桃；NAC轉錄因子；成熟期；保守區；系統進化樹

中圖分類號： S662.101 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）22-0046-04

NAC轉錄因子是一類植物特有的轉錄調控因子，1996年Souer等首先從矮牽牛中克隆得到[1]，隨后在擬南芥、水稻、小麥、大豆等中相繼發現。研究表明，NAC轉錄因子在植物的生長發育、形態建成、激素調節以及對生物和非生物逆境的抗性等方面發揮作用[2]。NAC轉錄因子最主要的結構特點是N端含有高度保守的NAC結構域，由約150個氨基酸殘基組成；C末端通常有簡單的重復氨基酸序列，富含絲氨酸，蘇氨酸、脯氨酸和谷氨酸，或者酸性氨基酸殘基，具有轉錄激活功能。

有研究者指出NAC轉錄因子調控植物生殖器官成熟和衰老。2006年，Uauy等從小麥中分離了NAM-B 1，功能分析顯示，它在野生小麥中加速植株衰老，促進葉片中營養物質向籽粒流動[3]。2011年，Balazadeh等從擬南芥中分離了ORS1，超表達ORS1轉化擬南芥，加速了轉化體衰老[4]。2013年，Zhou等從水稻中鑒定出OsNAP，發現它調控葉片衰老[5]。2014年，Kim等在擬南芥上發現NAC有調控衰老的功能[6]。2013年，Pirona等利用桃Contender×Ambra和NJWeeping×Bounty F2代分離群體、SNP檢測、遺傳圖譜構建、QTL定位、對候選基因的Sanger測序等技術，結合檢測等位基因在子代中的分離比例等，認為NAC基因在控制桃果實成熟期中發揮重要作用[7]。筆者前期克隆了小白桃和它的早熟芽變品種津柳早紅的NAC基因，發現二者核酸序列有多處差異，尤其是后者中核苷酸變異形成終止密碼子，導致翻譯提前終止（未發表資料）。那么，在其他不同成熟期的桃品種中，NAC基因結構是否存在多樣性？為了解答這個問題，筆者從11桃品種中克隆了NAC基因，希望通過分析其結構，能找到一些NAC發揮功能的線索。

1 材料與方法

1.1 材料

2014年6月從天津學香果蔬有限公司（位于天津市西青區楊柳青鎮大柳灘村）桃資源圃采集津柳早紅、萬壽紅等11個桃品種（表1）的嫩葉，液氮速凍，帶回實驗室置于-80 ℃超低溫冰箱中保存備用。

1.2 基因組DNA提取

采用北京康為世紀生物科技有限公司的復雜植物基因組DNA提取試劑盒基因組DNA。使用Nanodrop 2000檢測核酸純度和濃度。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測核酸完整性、潔凈度和有無其他類型核酸污染。保留純度和濃度符合要求的樣品，分別于-20 ℃保存。

1.3 NAC基因的PCR擴增及測序

從GDR數據庫（https：//www.rosaceae.org）獲取桃NAC基因序列信息，對5′UTR、外顯子區和3′UTR，用Primer Premier 5設計特異引物，委托上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應體系25 μL包括10×Ex Taq buffer 2.5 μL，dNTP Mixture 1.5 μL（2.5 mmol/L），模板cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL（20 μmol/L），Ex Taq DNA聚合酶0.2 μL（5 U/μL），其余用PCR級純水補充。反應程序：95 ℃預變性5 min；35個循環（94 ℃變性30 s，59 ℃退火45 s，72 ℃延伸 2 min）；最后72 ℃延伸8 min。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，目的條帶回收、純化（Takara膠回收試劑盒），連接至pMD18-T載體，熱激法轉化大腸桿菌DH5α，挑取陽性單克隆、搖菌，選取陽性克隆，送上海生工生物工程有限公司測序。

1.4 核酸序列比對和生物信息學分析

使用DNAman 5.2軟件進行核酸序列比對，結合參考基因組中NAC基因序列，區別各品種NAC基因的外顯子區和內含子區；使用ORF Finder在線工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/）獲得開放閱讀框和推導氨基酸序列；使用NCBI中的CDD工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）進行蛋白質結構域分析。

1.5 NAC同源蛋白及其系統進化分析

利用NCBI中的Blastp工具（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）搜索同源蛋白序列；使用DNAman進行序列比對；使用Mega 4.1軟件繪制系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 NAC基因的克隆及測序

根據GDR數據庫中桃NAC基因（ppa008301m）mRNA序列設計特異引物對：Forward primer為ATCCCTCTCTTTCTTTC TCTC，Reverse primer為ACCCCTACTCGATTTCTCCAC。以各品種基因組DNA為模板，分別進行PCR擴增，電泳檢測得到約 1 400 bp 片段（圖1、圖2）。將上述產物克隆測序，分別獲得各品種NAC基因的核苷酸序列。

2.2 NAC基因的結構及其遺傳多樣性

將NAC基因的DNA和cDNA序列進行比對，分析ORF和保守區。結果顯示，各品種的NAC基因編碼氨基酸157～385個，在氨基酸序列第16～140位存在1個NAC結構域，確認了NAC基因身份。DNA和cDNA序列比對發現，它由5′UTR區、3個外顯子區、2個內含子區和3′UTR區組成；在各區域均存在一定數量的變異（表2）：變異分為SNP和Indel 2類；第1外顯子區有1處SNP，但它為同義突變，沒有引起氨基酸序列變化；第2外顯子區存在3處SNP，其中津柳早紅品種（代號11）的第470位核苷酸為C，其他10個品種均為A，該SNP使氨基酸126位的賴氨酸變為精氨酸（K→R）（圖3-B），其余2處未引起氨基酸序列變化。第3外顯子區變異最多（圖3-A），非同義突變數量也最多，其中品種8在1 052～1 150位有一段99 bp的插入序列，引起插入33個氨基酸殘基；津柳早紅在559～560位有TT缺失，造成移碼突變，另外在569位有SNP，由T變G，出現終止密碼子，導致翻譯終止（圖3-C）。津柳早紅和小白桃（代號10）在第3外顯子區SNP和Indel變異數量非常多（圖3-A），說明這2個品種的NAC基因結構具有獨特性。

2.3 桃NAC同源蛋白及其系統進化分析

Blastp檢索同源蛋白，發現結果中絕大多數屬于NAC類成員。桃NAC基因與梅同源性最高，為97%，其次是鴨梨NAC，為89%。其他同源性較高的來自于蘋果、月季、湖北海棠、草莓等物種。將score值最高的19個同源蛋白序列（表3）下載到本地，進行同源性分析（圖3-E）。桃NAC（ref品種）與19種植物同源性在72%～97%之間。

這些NAC同源蛋白比對結果顯示，在NAC結構域保守性較高（圖3-E），在它之外則多態性較高。將桃各品種NAC氨基酸序列比對結果與其他物種同源序列比對結果結合起來分析發現：這些物種在126位（按照ref品種序列）賴氨[CM（25]酸高度保守，而津柳早紅品種突變為精氨酸（圖3-B、圖3-E），且其他參試品種均為賴氨酸；在191位絲氨酸高度保守，而早蟠品種為脯氨酸（圖3-C、圖3-F），且其他參試品種均為絲氨酸；在291～318位高度保守，而小白桃品種氨基酸中發生突變較多（圖3-D、圖3-G）。

Mega 4.1生成系統進化樹（圖4），各物種NAC分為3組，桃NAC與梅、鴨梨、栽培蘋果、湖北海棠、野草莓亞種、月季、川桑等聚為一組；可可、樹棉、雷蒙德氏棉、陸地棉、葡萄、胡麻等為一組；橙、克萊門柚、麻風樹、歐洲水青岡等為一組。桃NAC與梅NAC72聚為一小支，與同源性分析結果一致。進化樹體現了親緣關系的遠近，如雷蒙德氏棉、陸地棉聚為一支，橙、克萊門柚聚為一支，薔薇科果樹及木本觀賞植物形成一組等。

3 討論

前人研究發現，NAC蛋白N端含有NAC結構域，氨基酸序列比較保守，C端則含有轉錄激活區，多樣性比較高。本研究對不同果實成熟期的桃品種NAC蛋白氨基酸序列比對結果符合上述規律：在第1、2外顯子區核苷酸變異少，其中多數是同義突變，不引起氨基酸序列變化；第3外顯子區多樣性非常豐富，而且引起的氨基酸序列變化比較多。本研究比對20個物種的NAC同源蛋白，發現N端氨基酸序列比較保守，而C端多樣性較高，與前人在其他物種上的研究結論一致。津柳早紅品種NAC蛋白翻譯提前終止，導致轉錄激活區部分缺失，可能會影響其生物學功能或效能，進而引起果實提早成熟，但是需要進一步試驗驗證。小白桃在C端存在一段特殊的氨基酸序列，有別于其他參試桃品種，具有獨特性。

Ooka等認為在NAC保守結構域中包含5個亞結構域（A、B、C、D、E），其中A、C、D高度保守，B和E保守性不強[8]。前人研究發現，在NAC蛋白中個別氨基酸突變會顯著影響其生物學功能。在擬南芥cuc1突變體中，cuc1-1蛋白在123位氨基酸處由賴氨酸突變為蘇氨酸（屬于D亞結構域），可能影響它核定位和DNA結合，致使突變體不能形成莖頂端分生組織[2，9]。本研究中，NAC同源蛋白在126位（按照ref品種序列）賴氨酸高度保守（屬于D亞結構域），而津柳早紅品種為精氨酸；在191位絲氨酸高度保守，而早蟠品種為脯氨酸，從類型上講，從極性氨基酸突變為非極性氨基酸，性質變化比較大。因此，這2處變異很有可能導致蛋白功能或效能的明顯變化。

不同物種同源蛋白的系統進化樹分析通常能獲得與基于表型性狀的植物分類學相同或相近的結果。張亮等研究了新疆栽培扁桃CBF1轉錄因子基因，在對不同植物CBF氨基酸序列進行系統進化樹分析時發現，它與甜櫻桃、梅親緣關系最近，而且三者與野生扁桃、山桃、桃、光核桃、新疆桃等聚成一組[10]。陳清等研究黑莓RuMYB10 基因，系統進化樹分析同源蛋白發現，同屬懸鉤子屬的歐洲紅樹莓與RuMYB10 分化時間很近；物種間MYB基本等同于物種分類地位：同屬薔薇科的蘋果亞科、李（梅）亞科和薔薇亞科各自聚為小枝后匯為一大類[11]。本研究中，NAC同源蛋白系統進化樹也體現了植物親緣關系，桃NAC與梅NAC72聚為一小枝，雷蒙德氏棉、陸地棉聚為一枝，橙、克萊門柚聚為一枝，薔薇科植物聚成一組等。

NAC基因是桃果實成熟期性狀的候選基因之一[7]。Eduardo等利用桃分離群體研究發現緩慢成熟性狀是單基因控制，它與果實成熟期性狀共分離，從NAC基因中開發了一個SCAR標記（PSR2）用于鑒定后代成熟性狀[12]。Nuez-Lillo等利用桃F2群體研究發現，NAC與緩慢成熟性狀共分離，認為NAC和ERF4 是成熟期性狀和果肉粉狀性狀的候選基因[13]。

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