甘薯黑斑病抗性鑒定中黑斑病菌培養方法研究

禹陽+賈趙東+馬佩勇+郭小丁+謝一芝+邊小峰

摘要： 黑斑病是甘薯生產上的重要病害，選育抗黑斑病的甘薯品種是防治黑斑病的重要途徑之一。黑斑病抗性鑒定是甘薯抗病育種的基礎，然而目前采用的甘薯黑斑病抗性鑒定方法仍存在不足，尤其是病原菌的純化和準備。利用甘薯液體培養基對黑斑病菌進行擴大培養，成功接種蘇薯8號和華東51-93并致病。采用該培養方法連續2年對蘇渝303等8個品種進行黑斑病抗性鑒定，鑒定結果較為穩定一致，能有效反映甘薯品種對黑斑病的抗性水平。該培養方法科學高效，操作簡單，不易污染，從而可為甘薯抗黑斑病品種選育提供高效精準的抗性鑒定方法。

關鍵詞： 甘薯；黑斑病；病原菌培養；抗性鑒定

中圖分類號： S435.313+.1 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）22-0120-02

由甘薯長喙殼菌（Ceratocystis fimbriata Ellis et Halsted）侵染引起的甘薯黑斑病（sweetpotato black rot）是甘薯生產上一種重要病害，在我國各甘薯產區均有發生。該病能造成甘薯儲藏時爛窖，育苗時爛床和死苗，對甘薯生產影響極大。其中病薯毒害較大，如用病薯喂養牲畜，會發生氣喘病而死亡；用病薯釀酒，則發酵遲緩并降低乙醇的產量與質量，嚴重制約甘薯產業的發展[1]。甘薯黑斑病可通過種薯、薯苗及土壤等多種途徑傳播[2]，很難徹底根除，因此選育抗黑斑病甘薯品種是防治黑斑病的重要途徑之一。

黑斑病抗性鑒定是甘薯抗病育種的基礎，目前生產上采用的鑒定方法主要有田間人工接種鑒定、田間自然誘發鑒定、室內薯塊人工接種鑒定、室內薯苗人工接種鑒定等。由于田間鑒定費時費工、受外界環境影響較大，組織幼嫩的薯苗接種會致發病較重、不易區分品種抗性等級，一般多采用室內薯塊人工接種鑒定法[3-4]。然而此法在使用過程中仍有不足，尤其是病原菌的擴繁效率和純度。本研究通過利用甘薯液體培養基培養黑斑病菌，極大程度改善了傳統薯片法的缺陷，可為甘薯黑斑病的高效精準鑒定提供新的參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

用于黑斑病菌活力鑒定的蘇薯8號和華東51-93，以及用于黑斑病抗性鑒定的蘇渝303等8個甘薯品種均由江蘇省農業科學院糧食作物研究所甘薯研究室提供和保存。

1.2 病原菌分離和純化

從田間采集黑斑病發病薯塊，通過組織分離法分離黑斑病菌。分離時洗去薯塊表面泥土，并用75%乙醇進行表面消毒，在超凈工作臺上將病斑表皮去除，取病斑部并切成小塊。將病斑部接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）平板上培養，經分離純化和柯赫氏法則驗證確定。

1.3 黑斑病菌的培養和孢子懸浮液制備

取2 g薯塊（薯塊顏色白色為宜），加水煮沸并攪拌，使薯塊徹底勻漿在溶液中，紗布過濾，將濾液高壓滅菌制備甘薯液體培養基。將分離純化的黑斑病菌接入甘薯液體培養基中，28 ℃搖床150～200 r/min培養20～24 h。滅菌紗布過濾去除菌絲后，6 000 r/min離心5 min，之后用無菌水懸浮獲得孢子懸浮液，并將其D600 nm調至1.0。

1.4 病原菌接種與薯塊處理

采用針刺接種法接種，用醫用注射針頭蘸取配好的菌液，穿刺測試的薯塊進行接種，每個薯塊接種15個點（注意：每針刺1次，針頭需蘸取菌液），深度0.5 cm。接種后的薯塊裝入消毒的塑料箱中，加蓋消毒紗布，置于25～28 ℃的恒溫室中，每天上午、下午各用溫水澆濕覆蓋紗布1次進行保濕。

1.5 發病情況調查

每個測試品種重復接種4～10次，接種15 d后測量薯塊的病斑表面直徑，計算平均病斑直徑并確定其抗病等級。

具體評價標準為：直徑<1.0 cm，高抗；1.0 cm≤直徑<1.3 cm，抗病；1.3 cm≤直徑<1.6 cm，中抗；1.6 cm≤直徑<1.9 cm，感病；直徑≥1.9 cm，高感。

2 結果與分析

2.1 利用甘薯液體培養基擴大培養黑斑病菌的活力鑒定

將分離得到的黑斑病菌接入甘薯液體培養基中過夜培養，紗布過濾離心后制成孢子懸浮液。經顯微鏡鏡檢發現，孢子懸浮液中雜質較少，且孢子形態正常（圖1-A）。為鑒定孢子是否有活力，采用室內薯塊人工接種法對蘇薯8號和華東51-93進行黑斑病菌接種預試驗。試驗發現，接種2 d后在蘇薯8號和華東51-93的薯塊表面即出現黑斑病病斑，且隨著接種天數的延長病斑越明顯，接種10 d后的病菌在甘薯薯塊縱切面有不同程度的致病（圖1-B）。該結果證明，通過甘[CM（25]薯液體培養基擴大培養的黑斑病菌能夠明顯減少雜菌污

染，孢子活力大，可以成功使甘薯發病，能夠用于生產上的甘薯黑斑病抗性鑒定。

2.2 利用液體培養黑斑病菌進行品種抗性鑒定

利用甘薯液體培養基培養黑斑病菌的方法，于2016、2017年采用室內薯塊人工接種法對蘇渝303等8個品種進行黑斑病抗性鑒定。其中鑒定出抗病品種2個，分別為寧 W50-20 和南京1063；中抗品種4個，分別是蘇渝303、寧紫1號、徐薯36和寧104-1；感病品種2個，分別為徐紫8號和寧W50-13。通過分析2年的數據發現，利用甘薯液體培養基培養黑斑病菌進行甘薯黑斑病抗性鑒定的結果較為穩定一致，說明該培養方法能夠科學可靠地反映供試材料的抗病性。

3 討論與結論

甘薯黑斑病的傳播途徑較多，在生產上屬于頑固性病害，難以徹底根除，因此選育抗病品種是防治黑斑病的重要途徑之一。黑斑病抗性鑒定作為甘薯抗病性研究的重要環節，其科學有效性將直接影響甘薯抗黑斑病品種的選育。

目前，生產上普遍采用傳統的薯片法培養黑斑病菌進行甘薯黑斑病抗性的室內薯塊人工接種鑒定[5]，即將切好的薯片放入加水稀釋的搗爛薯塊黑斑病病斑部，內浸后晾干表面水分，在無菌培養皿內培養5～6 d至薯片表面長滿淺灰色的分生孢子，之后制成孢子懸浮液以接種。在這個過程中，不僅薯片易腐爛，也容易混入雜菌，且耗時較長，因此無法科學精準地對甘薯品種黑斑病的抗性作出評價。液體培養基擴大培養真菌孢子進行植物抗病性鑒定的方法已在多種農作物中被廣泛應用，該方法具有周期短、污染少、靈敏性高等特點，為植物抗病品種選育提供了切實可靠有效的指導[6-7]。借鑒這些農作物的真菌病害鑒定方法，本研究對傳統的甘薯黑斑病抗性鑒定方法進行了改進。與傳統的薯片法相比，利用甘薯液體培養基對分離純化的甘薯黑斑病菌進行擴大培養只需 20～24 h，不僅能夠極大縮短黑斑病菌的增殖時間，而且操作過程簡單、條件可控、不易污染。此外，由此制備的孢子懸浮液中雜菌少，孢子活力強。

采用甘薯液體培養基培養黑斑病菌的方法，連續2年對蘇渝303等8個甘薯品種進行黑斑病抗性鑒定的結果較為穩定一致，進一步說明該培養方法的鑒定結果科學準確，能夠有效反映甘薯品種對黑斑病的抗性水平，可以為甘薯抗黑斑病品種選育提供高效的抗性鑒定方法。

參考文獻：

[1] 陳利鋒，徐敬友. 農業植物病理學[M]. 3版.北京：中國農業出版社，2007：201-205.

[2]江蘇省農業科學院，山東省農業科學院.中國甘薯栽培學[M]. 上海：上海科學技術出版社，1984：201-203，265-270.

[3]馮啟渙，陸漱韻，王莉莉，等. 甘薯黑斑病人工接種方法研究[J]. 中國農業大學學報，1998，3（1）：50-56.

[4]賈趙東，郭小丁，尹晴紅，等. 甘薯黑斑病的研究現狀與展望[J]. 江蘇農業科學，2011，39（1）：144-147.

[5]謝一芝，尹晴紅，戴起偉，等. 甘薯品種抗黑斑病鑒定及其遺傳趨勢[J]. 植物遺傳資源學報，2003，4（4）：311-313.

[6]沈萬寬，姜子德，楊湛端，等. 甘蔗抗黑穗病的鑒定新方法及其品種抗性評價[J]. 華中農業大學學報，2014，33（2）：51-56.

[7]周淼平，姚金保，張 鵬，等. 小麥幼苗紋枯病抗性評價新方法[J]. 江蘇農業學報，2017，33（1）：61-66.