蟬花真菌的分離及液體發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

黃小忠+謝正林+許俊齊+張寶珍

摘要： 通過蟬花僵蟲體、子座芽、孢子3個部分的分離培養(yǎng)，利用單因素和正交試驗，優(yōu)化生產(chǎn)蟲草酸各營養(yǎng)因子的最佳種類和配比，以達到蟬花真菌的分離及液體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化效果。結(jié)果表明，分離得到的蟬花真菌為擬青霉屬蟬擬青霉[Paecilomyces cicadae （Miquel.） Samson]；工藝優(yōu)化后得出蟬花液體發(fā)酵最佳培養(yǎng)基配方為蔗糖40 g/L、蛋白胨15 g/L、KH2PO4 1.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L；生物量和蟲草酸總產(chǎn)量能分別提高1.852 g/L、17.774 mg/g。

關(guān)鍵詞： 蟬花真菌；分離培養(yǎng)；液體發(fā)酵；工藝優(yōu)化；培養(yǎng)基優(yōu)化

中圖分類號： S567.3+90.43 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）22-0153-03

蟬花（Cordyceps cicadae）別稱蟬蟲草、蟬茸、胡蟬等，主要產(chǎn)于江浙一帶丘陵竹林中，云南和四川等地也有分布。蟬花藥性甘寒、無毒，《本草綱目》記載“蟬花可治療驚癇，夜啼心悸，功同蟬蛻”。蟬花中含有豐富的氨基酸、蛋白質(zhì)、真菌多糖等生理活性物質(zhì)，具有鎮(zhèn)痛退熱、鎮(zhèn)靜明目、降低血壓、抗疲勞、抗腫瘤及提高免疫力的功效[1]。蟬花一般生長在針闊混交林帶，山巒平緩起伏，生態(tài)環(huán)境優(yōu)良，分布滿山遍野的毛竹林，陰蔽較好的林地都有金蟬花，尤其在向陽坡地的竹林下，落葉和腐殖層很厚，透氣、透水、保溫，密布粗壯、濃白的菌絲體[2-4]。

由于野生蟬花生長環(huán)境被破壞及濫采現(xiàn)象嚴重，導致當前野生蟬花資源日益減少，另外人工采集野生蟬花勞動強度大，其作為中藥材走向國際市場存在功能活性組分不明、原料不純等問題[5-6]。本研究通過用蟬擬青霉[Paecilomyces cicadae （Miquel.） Samson]的分離培養(yǎng)，優(yōu)化液體發(fā)酵工藝來生產(chǎn)菌絲體，旨在解決以上資源短缺及產(chǎn)品品質(zhì)等問題。

1 材料與方法

1.1 蟬花來源

蟬花標本采集于江蘇省句容市磨盤山海拔高度200～400 m的竹林中，冰袋低溫保存新鮮金蟬花，24 h內(nèi)處理。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑

甘露醇標準品、Nash（乙酸銨、冰醋酸、乙酰丙酮）、高碘酸鈉、L-鼠李糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、麩皮、蛋白胨、酵母膏、豆粉、酪蛋白、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、KCl、CaCl2。

1.2.3 儀器

水浴恒溫振蕩器（SHZ-28A，江蘇省太倉市華美生化儀器廠）；電子天平（KF6102，浙江凱豐集團有限公司）；千分之一精密電子天平（JA5003N，上海精密科學儀器有限公司）；立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-4，江蘇省金壇市杰瑞爾電器有限公司）；可見分光光度計（WFJ-7200，上海尤尼柯儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基

1.3.1.1 分離培養(yǎng)基

土豆15.00%，葡萄糖2.00%，蛋白胨0.20%，KH2PO4 0.10%，MgSO4·7H2O 0.05%，瓊脂粉 1.50%；pH值自然，121 ℃滅菌30 min。

1.3.1.2 母種培養(yǎng)基

土豆20.00%，葡萄糖2.00%，蛋白胨0.15%，KH2PO4 0.10%，MgSO4·7H2O 0.05%，瓊脂粉 1.50%～2.00%；pH值自然，121 ℃滅菌30 min。

1.3.1.3 液體菌種培養(yǎng)基

土豆20.00%，蔗糖5.00%，豆粉0.50%，KH2PO4 0.50%，MgSO4·7H2O 0.05%；pH值自然，121 ℃滅菌30 min。

1.3.2 蟬花真菌的分離培養(yǎng)

1.3.2.1 僵蟲體分離

無菌水浸泡蟲體10 min攪拌出泥沙，0.1%氯化汞溶液浸泡2～3 min，75%乙醇棉球擦拭，無菌水漂洗3次；取蟲體前段，切開外殼，取血腔菌絲3～4 mm，接入分離培養(yǎng)基[2]；于28 ℃培養(yǎng)48 h，分離培養(yǎng)去雜菌，移入試管斜面培養(yǎng)并低溫保存。

1.3.2.2 子座芽分離

取子座芽，無菌水洗凈，0.1%氯化汞溶液浸泡2～3 min，無菌水洗凈，取中間3～4 mm組織塊接入培養(yǎng)基，置于28 ℃培養(yǎng)48 h，挑取少量菌絲分離培養(yǎng)去雜菌，移入試管斜面培養(yǎng)并低溫保存。

1.3.2.3 孢子分離

取無菌紙袋套住蟬花（花蕾），反復振蕩，使孢子黏附到袋壁上，將紙浸入25%葡萄糖液中，洗孢子，混勻。取0.1 mL原液，加入1.0 mL無菌水，1.0 mL 01% NaOH，2～3 min后加入無菌水，離心洗滌3次，加入25%葡萄糖溶液，28 ℃培養(yǎng)。每天鏡檢，孢子萌發(fā)后，微吸管吸取單個孢子滴于平板中培養(yǎng)。

1.3.3 種子發(fā)酵液培養(yǎng)

1.3.3.1 菌種活化

將保藏的金蟬花菌種無菌操作接種至試管斜面上，25 ℃下培養(yǎng)5～7 d，此時菌絲長滿斜面，即可使用。

1.3.3.2 種子液制備

從斜面上取大小相近的0.5 cm×0.5 cm 的母種塊，接種于液體培養(yǎng)基中（菌塊要薄，稍帶培養(yǎng)基，盡量使菌塊漂浮在液面上），每瓶接種3塊。裝液量為40%，培養(yǎng)溫度為25 ℃，轉(zhuǎn)速為180 r/min，一級種培養(yǎng)3 d，二級種在與一級種同樣條件下培養(yǎng)2 d。

1.3.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)

裝液量為40%，接種量為10%，培養(yǎng)溫度為25 ℃，轉(zhuǎn)速為180 r/min，培養(yǎng)48 h，靜置16 h。每個試驗3次重復。250 mL三角瓶分裝，100 mL/瓶。endprint

1.3.4 液體培養(yǎng)基優(yōu)化工藝

1.3.4.1 碳源篩選

以豆粉2.00%、KH2PO4 0.10%、MgSO4·7H2O 0.05%為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別加入3.00%的葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、甘露醇5種碳源，pH值自然，于25 ℃、180 r/min 恒溫水浴搖床培養(yǎng)5 d，分別對比這5種碳源對生物量及蟲草酸含量的影響。其中，豆粉煮沸20 min，經(jīng)過濾取濾液加入。

1.3.4.2 氮源篩選

以蔗糖2.00%、可溶性淀粉1.00%、KH2PO4 0.10%、MgSO4·7H2O 0.05%為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別將蛋白胨、酵母膏、麩皮、酪蛋白、豆粉5種氮源以2.00%的量加入，pH值自然，于25 ℃、180 r/min恒溫水浴搖床培養(yǎng)5 d，分別對比這5種碳源對生物量及蟲草酸含量的影響。其中，麩皮經(jīng)煮沸水解10 min后，經(jīng)過濾取濾液加入。

1.3.4.3 無機鹽篩選

以蛋白胨2.00%、蔗糖2.00%為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別加入0.05%的KH2PO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、KCl、CaCl2 5種無機鹽，pH值自然，于25 ℃、180 r/min恒溫水浴搖床培養(yǎng)5 d，分別對比這5種碳源對生物量及蟲草酸含量的影響。

1.3.4.4 生物量的測定

采用細胞干重法[7]，取液體培養(yǎng)后發(fā)酵液，用100目尼龍紗網(wǎng)過濾得菌絲體和胞外液，并用蒸餾水反復沖洗，至濾出液澄清為止，收集菌絲體，60 ℃烘干至恒質(zhì)量，稱質(zhì)量。

1.3.4.5 蟲草酸含量測定

取樣品液1 mL，用高碘酸鈉比色法[8-9]在420 nm處測吸光度，制作甘露醇標準曲線見圖1，并計算樣品中的蟲草酸含量（mg/g）=C×50/m。式中：C為提取液中的蟲草酸含量（mg/mL）；50是樣品提取液體積（mL）；m為稱取樣品的質(zhì)量（g）。

1.3.4.6 不同因素和水平正交試驗優(yōu)化研究

培養(yǎng)溫度 25 ℃、初始pH值自然、接種量10%、接種菌齡4 d、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min、培養(yǎng)時間5 d，在碳源、氮源、無機鹽單因素試驗基礎(chǔ)上，進行4個因素4個水平[L16（44）]正交試驗設計考察，具體設計見表1。發(fā)酵結(jié)果經(jīng)極差和方差分析，找出各種培養(yǎng)基成分的最佳濃度和它們對蟬花生物量和蟲草酸含量的影響程度。

1.3.4.7 驗證試驗

將正交試驗所獲得的最佳培養(yǎng)工藝條件進一步驗證，并設置對照，比較優(yōu)化培養(yǎng)基與基礎(chǔ)培養(yǎng)基同條件下蟬花真菌生物量及蟲草酸含量的差異。

1.3.4.8 數(shù)理統(tǒng)計方法

試驗數(shù)據(jù)用SPSS進行統(tǒng)計分析，并進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蟬花真菌的分離與鑒定

僵蟲體、子座芽和孢子3種來源的組織材料均可以分離得到蟬花真菌。子座芽和孢子的分離效果較好，雜菌污染率較低，菌落生長48 h左右即可見，起初星狀放射生長、菌絲平伏，菌絲逐漸呈白色絨毛狀，菌落白色、圓形隆起，表面有細小水珠，之后中間顏色加深，呈紫色，初步鑒定為擬青霉屬的蟬擬青霉。僵蟲體分離染菌率較高，分離效果略差。

2.2 蟬花真菌液體培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 蟬花真菌液體培養(yǎng)基的碳源篩選

由表2可知，在5種碳源中，葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖和乳糖都能得到較高的生物量，而蟲草酸含量最高的是甘露醇，由于標準品的主要成分是甘露醇，所以適合的碳源是蔗糖，蟲草酸的含量是28148 mg/g。

2.2.2 蟬花真菌液體培養(yǎng)基的氮源篩選

由表3可知，不同氮源對蟲草酸含量及生物量的影響較大。在5種氮源中，蛋白胨和豆粉對蟬花液體發(fā)酵蟲草酸含量的影響比較明顯，但是豆粉在碳源篩選中作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的氮源，對氮源篩選有一定干擾，所以合適的氮源是蛋白胨，其生物量為 1.361 g/L，蟲草酸含量為 32.284 mg/g。

2.2.3 蟬花真菌液體培養(yǎng)基的無機鹽篩選

由表4可以看出，5種無機鹽對生物量的影響不是很大，但根據(jù)蟲草酸含量可以看出，MgSO4·7H2O和KH2PO4、K2HPO4能同時獲得高產(chǎn)量的蟲草酸。值得注意的是，CaCl2的添加反而抑制了蟲草酸的產(chǎn)生。基于鉀（K）、磷（P）、硫（S）、鎂（Mg）作為微生物生長所需的營養(yǎng)元素和蟲草素產(chǎn)量考慮，同時選用 MgSO4·7H2O、KH2PO4為培養(yǎng)基中的無機鹽組分，保證微生物能更好生長。

2.3 蟬花真菌液體培養(yǎng)基的正交試驗結(jié)果

從表5直觀分析可以看出，培養(yǎng)基的成分對蟬花液體發(fā)酵產(chǎn)生生物量的影響順序為蔗糖>蛋白胨>KH2PO4>MgSO4·7H2O，最優(yōu)水平為A3B4C1D1，即蔗糖30 g/L、蛋白胨25 g/L、KH2PO4 0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L。

培養(yǎng)基成分對蟬花液體發(fā)酵產(chǎn)生蟲草酸含量的影響順序為蔗糖>蛋白胨>KH2PO4>MgSO4·7H2O，最優(yōu)水平為A4B2C3D1，即蔗糖40 g/L、蛋白胨15 g/L、KH2PO4 1.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L。在上述優(yōu)化條件下，蟬花生物量和蟬花蟲草酸含量都要比正交試驗最高組（第10組）高。由以上分析可知，蟬花生物量和蟲草酸含量呈正相關(guān)，生物量的大量產(chǎn)生是蟲草酸積累的基礎(chǔ)。

2.4 基礎(chǔ)培養(yǎng)基和改良培養(yǎng)基驗證試驗結(jié)果

從表6可知，在驗證試驗中，工藝優(yōu)化后蟬花生物量和蟲草酸含量都有所提高，優(yōu)化后生物量提高1.852 g/L，蟲草酸含量提高17.774 mg/g。說明優(yōu)化后各種適宜濃度的營養(yǎng)因子能更好地促進生物量和蟲草酸的產(chǎn)生。

3 結(jié)論與討論endprint

碳源優(yōu)化試驗中培養(yǎng)基中加入豆粉、麩皮效果較好，可能與向真菌寄主體內(nèi)提供類似的激素等促進因子有關(guān)。在本研究中，蟬花菌株的生長和蟲草酸產(chǎn)生的最佳碳源是蔗糖，也有用葡萄糖作為小試發(fā)酵碳源的報道，但從生產(chǎn)成本來看，蔗糖更適合工業(yè)生產(chǎn)。氮是有機體的重要組成元素，本試驗中有機氮源比無機氮源能獲得更高的生物量和代謝產(chǎn)物，優(yōu)化后以15 g/L蛋白胨添加量作為氮源獲得總的蟲草酸含量達到44.317 mg/g，說明適量的蛋白胨可促進蟲草酸的產(chǎn)生。有報道發(fā)現(xiàn)，添加NH4+不僅能夠成倍地增加蟲草酸含量，同時還在一定程度上提高了胞外多糖的產(chǎn)量[10]。無機鹽在蟬花的生長和蟲草酸的產(chǎn)生中起著重要作用。本試驗中添加的幾種無機鹽均能提高蟲草酸的產(chǎn)量，Ca2+效果較不明顯，可能影響蟲草酸的積累。

從蟬花液體發(fā)酵過程分析可知，蟬花真菌的分離、菌種的純化、液體菌種的培養(yǎng)等因素對生物量和蟲草酸的總產(chǎn)量都有很大的影響，更重要的是液體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化對培養(yǎng)的碳源、氮源、無機鹽、溫度、搖床的轉(zhuǎn)速等必要因素的考察更具有價值，這也為進一步提高蟬花發(fā)酵生產(chǎn)蟲草酸和優(yōu)質(zhì)菌絲體的生產(chǎn)效率提供參考，對提高經(jīng)濟效益有重要的意義。

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