黑果枸杞總黃酮提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性

古麗巴哈爾?卡吾力+高曉黎+常占瑛+古麗格娜?吐?tīng)柕?王玲+謝湘云

摘要： 應(yīng)用水提法提取黑果枸杞中總黃酮，采用單因素和Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，利用響應(yīng)面分析法選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、提取溫度以及料液比進(jìn)行4因素3水平試驗(yàn)，優(yōu)化黑果枸杞總黃酮的提取工藝，并測(cè)定總黃酮清除超氧陰離子、DPPH和羥自由基的能力，初步考察其抗氧化活性。結(jié)果表明：水浴提取的最優(yōu)工藝參數(shù)為乙醇的體積分?jǐn)?shù)為79.6%，提取時(shí)間為60.8 min，料液比為1 g ∶ 15.6 mL，提取溫度為70.2 ℃。在此優(yōu)化條件下，黑果枸杞總黃酮的提取量可達(dá)到69.02 μg/mL。其中影響提取工藝參數(shù)的主次因素為料液比>乙醇體積分?jǐn)?shù)>提取溫度>提取時(shí)間。總黃酮對(duì)超氧陰離子、DPPH和羥自由基清除能力可以達(dá)到59.32%、72.68%、46.14%，說(shuō)明黑果枸杞總黃酮具有一定的抗氧化活性。

關(guān)鍵詞： 黑果枸杞；總黃酮；響應(yīng)面；抗氧化活性

中圖分類號(hào)： R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）22-0213-05

黑果枸杞（Lycium ruthenicum）為茄科枸杞屬的一個(gè)物種，具棘刺，漿果球形，皮薄，皮熟后紫黑色，果實(shí)含豐富的紫紅色素，極易溶于水，屬天然的水溶性花色苷黃酮類。主要出產(chǎn)于甘肅酒泉、新疆、內(nèi)蒙、青海等沙漠地帶，海拔高、氣候干旱，生態(tài)環(huán)境潔凈、無(wú)污染。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)關(guān)于黑枸杞的功效論述為，黑枸杞能滋補(bǔ)肝腎、益精明目、適用于腰膝酸軟、頭暈?zāi)垦！裳刍杌ǖ劝Y狀，藏醫(yī)藥經(jīng)典《四部醫(yī)典》《晶珠本草》等記載黑果枸杞主治心熱病、心臟病、月經(jīng)不調(diào)、停經(jīng)等。《維吾爾藥志》記載維吾爾醫(yī)生常用黑果枸杞果實(shí)及根皮治療尿道結(jié)石、癬疥、齒齦出血等癥，民間作滋補(bǔ)強(qiáng)壯以及降壓藥。現(xiàn)代科學(xué)研究證實(shí)了上述說(shuō)法，并且認(rèn)為黑果枸杞可以降低膽固醇，興奮大腦神經(jīng)，增強(qiáng)免疫功能，防治癌癥，抗氧化、抗衰老和美容，黑果枸杞提取物可促進(jìn)細(xì)胞免疫功能，增強(qiáng)淋巴細(xì)胞增殖及腫瘤壞死因子的生成，對(duì)白細(xì)胞介素Ⅱ有雙向調(diào)節(jié)作用，能緩解糖尿病患者多飲多食、體重減輕癥[1-4]。

黃酮類化合物是一大類天然產(chǎn)物，廣泛存在于植物界，是許多中草藥的有效成分。在自然界中最常見(jiàn)的是黃酮和黃酮醇，其他包括雙氫黃（醇）、異黃酮、雙黃酮、黃烷醇、查爾酮、橙酮、花色苷及新黃酮類等。人們發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物有抗炎、抗病毒、利膽、強(qiáng)心、鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛等作用。到20世紀(jì)70年代，又發(fā)現(xiàn)它們有抗氧化、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤等作用[5-8]。為此，本試驗(yàn)采用單因素和Box-Behnken試驗(yàn)優(yōu)化黑果枸杞總黃酮的提取工藝參數(shù)，并對(duì)總黃酮抗氧化活性進(jìn)行檢測(cè)，以期能為黑果枸杞開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)[9-13]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑果枸杞采自新疆維吾爾自治區(qū)阿克蘇市塔里木盆地。

蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品，成都曼斯特生物科技有限公司（UV級(jí)，純度為98.6%）；無(wú)水乙醇、鹽酸、亞硝酸鈉、硝酸鋁、純化水、氫氧化鈉、DPPH（2，2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl），Sigma-ALDRICH公司；無(wú)水乙醇、純水、氫氧化鈉、鹽酸、鐵氰化鉀、三氯乙酸、磷酸鹽緩沖液、水楊酸、雙氧水、硫酸亞鐵、抗壞血酸（維生素C）、硫酸銅、鄰苯三酚均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)UV-9100型，北京萊伯泰科儀器有限公司；扣壓式小型粉碎機(jī)XL-02A型，旭朗機(jī)械；電熱恒溫水浴鍋HWS24型，上海恒科學(xué)儀器有限公司；循環(huán)真空泵SHZ型，河南省鄭州博科儀器設(shè)備有限公司；電子天平XPE型，梅特勒-托利多；扣壓式小型粉碎機(jī)XL-02A型，旭朗機(jī)械。

1.3 方法

1.3.1 黑果枸杞總黃酮含量測(cè)定方法學(xué)考察

1.3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用60%乙醇溶解并定容至10 mL，搖勻得質(zhì)量濃度為1 mg/mL的蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 置于25 mL的容量瓶中各加水至10 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1.0 mL，溶液搖勻放置5 min，加10%硝酸鋁溶液10 mL，搖勻放置5 min，加4%氫氧化鈉溶液10 mL，加水至刻度，搖勻放置15 min，以相應(yīng)的試劑溶液為空白，在500 nm處測(cè)定吸光度。以蕓香苷質(zhì)量濃度（C，mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度（D）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程和相關(guān)系數(shù)為：C=9.493D+0.044，r2=0.998，標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好的擬合性。

1.3.1.2 精密度試驗(yàn)

準(zhǔn)確吸取0.05、0.15、0.25 mg/mL 3種濃度蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)溶液各1.0 mL，按照“1.3.1”節(jié)方法連續(xù)測(cè)定5次，分別計(jì)算總黃酮吸光度的RSD，其結(jié)果分別為 1.02%、113%、0.98%。

1.3.1.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

準(zhǔn)確吸取0.05、0.15、0.25 mg/mL 3種濃度蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)溶液各1.0 mL，按照“1.3.1”節(jié)方法分別在0、2、4、6、8、10 h測(cè)定，分別計(jì)算總黃酮吸光度的RSD，其結(jié)果分別為1.32%、2.08%、1.46%。

1.3.1.4 加標(biāo)回收率考察

準(zhǔn)確吸取9份已知總黃酮濃度的供試品各1.0 mL，分別加入0.05、0.15、0.25 mg/mL 3種濃度的蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液各1.0 mL，按照“1.3.1”節(jié)方法進(jìn)行測(cè)定，其平均回收率為98.31%、99.01%、99.72%。

1.3.2 黑果枸杞總黃酮提取及含量測(cè)定

將采集的黑果枸杞清洗后在陰涼處干燥至恒質(zhì)量，用粉碎機(jī)粉碎并過(guò)60目篩，索氏提取器用石油醚脫脂3.0 h，干燥后備用[14-18]。準(zhǔn)確稱取脫脂后黑果枸杞粉0.5 g，用不同體積分?jǐn)?shù)乙醇、不同提取溫度、不同提取時(shí)間和不同料液比進(jìn)行水浴提取并離心。離心后的提取液減壓濃縮，采用真空干燥箱干燥，再將干品用蒸餾水溶解，按照標(biāo)準(zhǔn)品含量測(cè)定的操作測(cè)定黑果枸杞總黃酮的提取量。endprint

1.3.3 單因素試驗(yàn)

根據(jù)黑果枸杞總黃酮提取方法，準(zhǔn)確稱取0.5 g黑果枸杞粉末，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)（60%、70%、80%、90%、100%）、提取時(shí)間（40、50、60、70、80 min）、料液比[1 ∶ 5、1 ∶ 7.5、1 ∶ 10、1 ∶ 12.5、1 ∶ 15（g/mL）]、提取溫度（50、60、70、80、90 ℃）對(duì)黑果枸杞總黃酮提取量的影響。

1.3.4 提取工藝響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以黑果枸杞總黃酮提取率為響應(yīng)值，乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、提取溫度、料液比為考察因素，利用響應(yīng)面4因素3水平試驗(yàn)對(duì)黑果枸杞總黃酮提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。采用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。試驗(yàn)因素和水平表見(jiàn)表1。

1.3.5 黑果枸杞總黃酮抗氧化活性測(cè)定

1.3.5.1 黑果枸杞總黃酮超氧陰離子清除能力

按照王建等的方法[19]配制總黃酮1.380、1.726、2.300、3.451、6.902 μg/mL 提取溶液，分別準(zhǔn)確吸取2.0 mL，恒溫25 ℃下將pH值為8.2的Tris-HCl緩沖液（50 mmol/L）3.0 mL與鄰苯三酚（50 mmol/L）10 μL迅速混合后，325 nm處測(cè)定吸光度，每隔30 s測(cè)定1次，持續(xù)5.0 min結(jié)束，以D為橫坐標(biāo)，時(shí)間為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸，其斜率為鄰苯三酚自氧化速率為D0。樣品組將pH值8.2的Tris-HCl緩沖液（50 mmol/L）3.0 mL加0.5 mL提取液用同樣方法測(cè)定，其斜率為Ds，按照下式進(jìn)行計(jì)算：

1.3.5.2 黑果枸杞總黃酮DPPH清除能力

按照Sone等的方法[20]配制總黃酮1.380、1.726、2.300、3.451、6.902 μg/mL 提取溶液，分別準(zhǔn)確吸取2.0 mL，加入2 mL 0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液混勻，避光放置30 min，517 nm處測(cè)定Dt。同法取2 mL蒸餾水加入2 mL 0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液測(cè)定吸光度記為D0。取2.0 mL提取液加入2 mL乙醇混勻測(cè)定吸光度為Db，按照一下公式計(jì)算DPPH自由基清除能力：

1.3.5.3 黑果枸杞總黃酮羥自由基清除能力

按照Milaevae等的方法[21]配制總黃酮1.380、1.726、2.300、3451、6.902 μg/mL提取溶液，分別準(zhǔn)確吸取2.0 mL，加入 9 mmol/L FeSO4 0.5 mL、9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液 2.0 mL、8.8 mmol/L的H2O2啟動(dòng)反應(yīng)，在37 ℃水浴0.5 h，以蒸餾水為對(duì)照，在510 nm處測(cè)定吸光值，記為Ds。對(duì)照組加入2.0 mL蒸餾水代替提取液，其余操作同上測(cè)定吸光值，記為D0，按照以下公式計(jì)算羥自由基清除能力，即：

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黑果枸杞總黃酮提取量的影響

變動(dòng)乙醇體積分?jǐn)?shù)，在提取溫度70 ℃，料液比1 g ∶ 10 mL條件下提取60 min并計(jì)算其提取量。乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黑果枸杞總黃酮提取量的影響見(jiàn)圖1。

由圖1可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高，黑果枸杞總黃酮提取量明顯增加；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)提高到80%時(shí)，黑果枸杞總黃酮提取量最高，再提高體積分?jǐn)?shù)提取量反而降低。結(jié)果表明，提高乙醇體積分?jǐn)?shù)能增加黑果枸杞中總黃酮向溶劑方向擴(kuò)散，但是再提高乙醇的體積分?jǐn)?shù)溶出總黃酮的同時(shí)，有一些醇溶性雜質(zhì)，脂溶性成分溶出量增加，使溶液黏度變大，增大了傳質(zhì)過(guò)程中溶劑的阻力，減慢了黑果枸杞總黃酮向溶劑擴(kuò)散，減少了粉末表面與溶劑之間黑果枸杞總黃酮濃度差，從而導(dǎo)致黑果枸杞總黃酮的提取量減少。

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)黑果枸杞總黃酮提取量的影響

改動(dòng)提取時(shí)間，以80%乙醇，在提取溫度70 ℃、料液比1 g ∶ 10 mL條件下提取并計(jì)算其提取量。提取時(shí)間對(duì)黑果枸杞總黃酮提取量的影響見(jiàn)圖2。由圖2可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，黑果枸杞總黃酮的提取量增加，但提取時(shí)間為80 min時(shí)，提取率開(kāi)始下降。結(jié)果表明，延長(zhǎng)提取時(shí)間，黑果枸杞總黃酮不斷溶出，進(jìn)入溶液，可以提高黑果枸杞總黃酮提取量。但提取一定時(shí)間以后總黃酮已基本溶出，繼續(xù)增加提取時(shí)間，總黃酮提取量反而下降。表明時(shí)間過(guò)長(zhǎng)對(duì)總黃酮的提取量無(wú)明顯影響，且延長(zhǎng)提取時(shí)間還會(huì)增加耗能，并考慮后期的工業(yè)化生產(chǎn)，提取時(shí)間在 80 min 左右為宜。

2.1.3 料液比對(duì)黑果枸杞總黃酮提取量的影響

改動(dòng)料液比，以80%乙醇，在70 ℃提取60 min條件下計(jì)算其提取量。料液比對(duì)黑果枸杞總黃酮提取量的影響見(jiàn)圖3。由圖3可知，隨著料液比的增加，黑果枸杞總黃酮的提取量雖增加，但到1 g ∶ 7.5 mL時(shí)提取量開(kāi)始下降。結(jié)果表明，料液比較低時(shí)，溶液很容易達(dá)到飽和，總黃酮未能充分溶出，提取量較低。當(dāng)料液比繼續(xù)增加時(shí)，雖然固體粉末與溶劑接觸面增加，但是黑果枸杞總黃酮量在大體積溶劑中的被稀釋，提取量反而增加，且在工業(yè)生產(chǎn)時(shí)可以節(jié)省部分材料。

2.1.4 提取溫度對(duì)黑果枸杞總黃酮提取量的影響

改動(dòng)提取溫度，以80%乙醇，在料液比1 g ∶ 10 mL提取60 min條件下并計(jì)算其提取量。提取溫度對(duì)黑果枸杞總黃酮提取量的影響見(jiàn)圖4。由圖4可知，隨著提取溫度的提高，黑果枸杞總黃酮的提取量增加，到提取溫度為70 ℃時(shí)，提取量達(dá)到頂點(diǎn)，以后隨著溫度提高黑果枸杞總黃酮提取量開(kāi)始下降。結(jié)果表明，提高提取溫度，增加黑果枸杞總黃酮在溶劑中的溶解度，到70 ℃左右達(dá)到最高提取量，但是溫度過(guò)高可能導(dǎo)致總黃酮的結(jié)構(gòu)被破壞，而且溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致黑果枸杞總黃酮的生物活性降低。endprint

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化黑果枸杞總黃酮提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、提取時(shí)間（B）、料液比（C）、提取溫度（D）為試驗(yàn)的4個(gè)因素，并以總黃酮的提取量為考察指標(biāo)，設(shè)計(jì)4個(gè)因素3個(gè)水平的響應(yīng)面設(shè)計(jì)。因素水平及編碼見(jiàn)表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2.2 Box-behnken試驗(yàn)結(jié)果

采用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)黑果枸杞總黃酮提取量進(jìn)行多元模型擬合分析，得到黑果枸杞總黃酮提取量與乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、料液比和提取溫度的多項(xiàng)二次回歸方程：

Y=60.19-3.61A-1.59B-5.83C+2.19D-1.60AB-4.89AC+1.06AD-6.57BC-0.93BD+3.87CD-10.46A2-6.52B2-3.33C2-4.82D2。

應(yīng)用軟件Design-Expert 8.0.6對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3結(jié)果顯示，響應(yīng)面模型F值為9.09，P<0.000 1回歸模型極顯著，失擬性為0.062 6，P>0.05不顯著，說(shuō)明此模型與實(shí)際情況擬合很好。R2=0.900 6，RAdj2=0.801 2，Rp2=0457 2，說(shuō)明預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值之間具有高度的相關(guān)性，模型方程能夠很好地反映真實(shí)的試驗(yàn)值。由表3可知，該模型中一次項(xiàng)A、C、D對(duì)該模型的影響達(dá)到顯著（P<0.05）。二次項(xiàng)中A2、B2、D2對(duì)模型的影響極顯著（P<0.01），C2對(duì)模型的影響顯著（P<0.05），且模型中AC（乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比）和BC（提取時(shí)間和料液比）之間具有交互相應(yīng)（P>005），彼此之間有影響。影響黑果枸杞總黃酮提取量的因素順序?yàn)椋毫弦罕龋–）>乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）>提取溫度（D）>提取時(shí)間（B）。

2.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化分析

響應(yīng)面圖可以直觀地反映交互作用[CM（25]的顯著程度，根據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)面圖（圖5）。由圖

5-A可知，提取時(shí)間較短時(shí)，提高乙醇體積分?jǐn)?shù)黑果枸杞總黃酮提取量有所提高，但相關(guān)性較差。 由圖5-B可知， 料液比較低時(shí)，提高乙醇體積分?jǐn)?shù)黑果枸杞總黃酮提取量明顯升高。增加料液比總黃酮提取量明顯減少，說(shuō)明乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比相關(guān)性較強(qiáng)。由圖5-C可知，提取溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)兩者同時(shí)提高時(shí)，黑果枸杞總黃酮提取量有所增加，但是差異不明顯，乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度相關(guān)性比較弱，無(wú)交互作用。由圖5-D可知，在較低料液比時(shí)，延長(zhǎng)提取時(shí)間，黑果枸杞總黃酮提取量有明顯的上升趨勢(shì)，彼此之間相關(guān)性強(qiáng)，有交互作用。由圖5-E可知，提取溫度和提取時(shí)間同時(shí)增加，提取量有部分上升趨勢(shì)，但是不明顯，響應(yīng)面圖比較平滑，相關(guān)性較差。由圖5-F可知，料液比和提取溫度相關(guān)性較強(qiáng)，響應(yīng)面圖較陡峭，隨著提取溫度的提高，在較低的料液比條件下，黑果枸杞總黃酮提取量明顯增加，呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。因此，為了進(jìn)一步探究各因素之間的交互作用，對(duì)Box-behnken試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了響應(yīng)面分析（表2）。根據(jù)建立的回歸模型得出黑果枸杞總黃酮的提取工藝參數(shù)分別為乙醇體積分?jǐn)?shù)79.6%、提取時(shí)間為 60.8 min、料液比為1 g ∶ 15.mL、提取溫度為70.2 ℃。按照優(yōu)化的條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)（n=3），其提取量可以達(dá)到 69.02 μg/mL， 說(shuō)明優(yōu)化工藝條件參數(shù)具

有一定的實(shí)際價(jià)值。

2.3 黑果枸杞總黃酮抗氧化活性

由圖6可知，隨著黑果枸杞總黃酮質(zhì)量濃度的增加，其總黃酮對(duì)超氧陰離子、DPPH、羥自由基清除能力逐漸提高，分別可以達(dá)到59.32%、72.68%、46.14%。說(shuō)明黑果枸杞總黃酮能清除體內(nèi)多余的自由基，清除率與總黃酮濃度有一定的量效關(guān)系，說(shuō)明黃酮有抗氧化活性。

3 結(jié)論

響應(yīng)面分析結(jié)果表明，提取黑果枸杞總黃酮的最佳組合為：乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、提取時(shí)間60 min、料液比 1 g ∶ 15 mL、提取溫度70 ℃。各因素對(duì)總黃酮提取量的影響程度為料液比（C）>乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）>提取溫度（D）>提取時(shí)間（B）。在此條件下實(shí)測(cè)黑果枸杞總黃酮的提取量為 69.02 μg/mL，與理論值相差0.120 1 μg/mL。回歸模型和響應(yīng)面分析結(jié)果表明，該提取方法合理、可行、穩(wěn)定。在此基礎(chǔ)上對(duì)黑果枸杞總黃酮對(duì)超氧陰離子、DPPH、羥自由基的清除能力進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果說(shuō)明，黑果枸杞總黃酮有較強(qiáng)的抗氧化活性。上述結(jié)果為今后黑果枸杞總黃酮提取工藝的放大研究、總黃酮的分離純化及結(jié)構(gòu)解析、功能機(jī)理研究等具有一定的參考價(jià)值[22-25]。

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