煙草不同部位內生細菌的多樣性

林麗+陳澤斌+何群香+徐松萍+華金珠+黃麗+徐勝光

摘要： 為了揭示煙草不同器官中內生細菌的分布規律，應用Illumina測序平臺的MiSeq高通量測序儀對煙草根、莖、葉中內生細菌的16S rDNA-V4區擴增子進行測序，對測得數據進行生物信息學分析，評價物種α多樣性和β多樣性。經FLASH軟件對序列進行拼接，莖、葉、根樣品分別獲得36 129、60 312、52 573條原始序列，經Qiime軟件過濾，再剔除宿主的葉綠體和線粒體序列，最終分別得到35 190、58 938、51 268條有效序列，在97%的序列相似性水平上，這些有效序列被Uparse軟件劃分為1 447、1 141、1 220個操作分類單元（OTUs）。序列比對結果表明，在根、莖、葉中芽球菌屬（Blastococcus）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）為優勢菌。類諾卡氏菌屬（Nocardioides）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、Gemmatimonadaceae屬、Gaiella屬、壤紅桿菌屬（Solirubrobacter）、假單胞菌屬（Pseudomonas）細菌表現出組織專一性，主成分分析表明，根和葉中內生細菌群落結構最為相似。煙草植株內蘊含豐富的細菌資源，受組織結構及成分因素影響表現出器官差異性，即莖>根>葉。通過對煙草不同部位內生細菌多樣性進行研究，可為煙草植物生物活性內生菌株的發掘利用提供理論依據。

關鍵詞： 煙草；營養器官；內生細菌；組成；多樣性；分布規律；生物信息學；宿主；優勢菌；基因工程菌

中圖分類號： S572.01；Q939.92 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）22-0274-05

植物內生細菌（endophytic baeteria）泛指那些在其生活中的一定階段或全部階段生活于健康植物體內對植物器官未引起明顯病害癥狀的微生物[1]。近年來，已知在地球上接近30種的高等植物中每個物種都與多種內生細菌共生[2]。對煙草植物中內生細菌的報道早就出現了，但大多采用一代測序進行研究分析，運用二代測序進行研究分析的報道少之又少。因此，本研究采用Illumina高通量測序平臺的MiSeq測序儀對煙草不同部位內生細菌的16S rDNA擴增子進行二代測序，相較于傳統的組織培養法以及基于一代測序的非培養方法，測序費用低，測序深度更大，檢測靈敏度更高，從而能更好地實現對煙草不同部位內生細菌種類的準確調查，從而加深對煙草內生細菌種群結構的了解。

內生細菌是一個多樣性豐富的微生物類群，生活于健康植物的各個組織和細胞間隙內，具有穩定的生存空間，不易受環境條件的影響，可以在植物體內獨立地分裂繁殖和傳遞，并與宿主植物協同進化[3]。內生細菌長期生活在植物組織內，與宿主形成共生關系，生態適應性強，產生活性物質，并參與信息轉導作用直接作用于宿主本身，植物內生細菌能夠促進宿主植物的生長、提高宿主植物的抗病蟲害能力、增強宿主植物抗逆性[4]，提高宿主植物對環境的適應性，加強系統的生態平衡。研究表明，高等植物中普遍存在內生細菌，據不完全文獻統計，截至2010年，在各種農作物及經濟作物中發現的內生細菌已超過129種，分屬于54個屬，主要為假單胞菌屬（Pseudomonas）、腸桿菌屬（Enterobacter）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、泛菌屬（Pantoea）、甲基桿菌屬（Methylobacterium）等[5]。陳澤斌等采用研磨組織稀釋分離法分離煙草植株中的內生細菌，對不同組織器官、不同生長期的煙草內生細菌菌群密度進行研究。結果表明，煙株的根、莖、葉中均存在大量的內生細菌，煙草內生細菌的分布存在品種差異、生長期差異、組織部位差異。在整個生育期中，以成熟期內生細菌的數量最多[6]。他們還采用稀釋平板法從健康煙草的根、莖、葉組織中分離到267株內生細菌，并利用細菌菌落表征性狀和16S rRNA序列對這些分離物進行多樣性分析。經克隆測序分析表明，這267株分離物分別與GenBank中6類細菌中的21個已知種相似性達到98%～99%[7]。王茂勝等為揭示煙草內生細菌多樣性，選擇K326、云85和紅花大金元3個烤煙品種進行內生細菌的分離和16S rDNA序列分析鑒定，獲得不同品種煙草內生細菌的多樣性特征。結果顯示，3個品種的香農指數以K326最高，為2.02；其次是云煙85，為1.48；紅花大金元最低，為1.30[8]。這些研究進展所采用的都是一代測序技術，然而早期一代測序技術普遍存在諸如文庫構建過程復雜、測序成本較高、通量低、難以做大量的平行測序等缺點。為了克服上述缺點，筆者利用近年來發展的新二代測序技術，不僅在文庫構建等方面取得了重要突破，進一步簡化了測序操作，降低了測序成本，縮短了測序時間；而且二代測序技術的出現使DNA測序的通量有所提高，原來只有在大型測序中心才能完成的測序任務現在已經可以在更多的實驗室展開。本研究采用近年來興起的Illumina MiSeq二代測序技術對煙草根、莖、葉內生細菌種類組成進行分析，相較于傳統的純培養方法及以16S rDNA為基礎的非培養方法，能夠產生測序覆蓋深度更大的數據量，從而對煙草內生細菌的種類進行全面而準確的調查，為豐富植物微生態學理論及基因工程菌的研究和應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2016年7月27日于云南省宣威市落水鎮試驗田隨機選取10株成熟期健康無明顯病害煙草，煙草品種為云煙87，采集其根、莖、葉放入無菌樣品袋中，均勻混合，低溫保鮮，24 h內進行表面消毒處理。

1.2 表面消毒

將烤煙根、莖、葉用滅菌水沖洗干凈，先用1%次氯酸鈉浸泡5 min，再用75%乙醇浸泡2 min，無菌水沖洗3次，用無菌濾紙吸干表面水分，表面消毒效果接近100%[9]。

1.3 總DNA提取

按參考文獻[10]所采用的CTAB方法提取根、莖、葉的總DNA，并用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢查DNA的完整度和濃度，并將剩余的樣品存于2 mL離心管中，使用無菌水稀釋樣品DNA至1 ng/μL。endprint