雷替曲塞聯合X線照射對人喉癌細胞Hep-2的協同作用

王 抒， 李 軒， 喬田奎

復旦大學附屬金山醫院腫瘤科，上海 201508

雷替曲塞聯合X線照射對人喉癌細胞Hep-2的協同作用

王 抒， 李 軒， 喬田奎*

復旦大學附屬金山醫院腫瘤科，上海 201508

目的探討雷替曲塞與X射線對人喉癌細胞Hep-2的協同作用及其潛在機制。方法CCK-8法檢測不同濃度雷替曲塞對Hep-2細胞活力的影響。將Hep-2細胞隨機分為對照組、雷替曲塞組、照射組、雷替曲塞+照射組。單擊多靶模型繪制細胞存活曲線，檢測4組細胞存活情況及放射增敏比(sensitization enhancement ratio，SER)；流式細胞儀檢測4組Hep-2細胞凋亡情況和周期改變。結果雷替曲塞能抑制Hep-2細胞活力，且呈劑量依賴性(P<0.05)。單擊多靶模型顯示，雷替曲塞平均致死劑量下SER為1.272。雷替曲塞能顯著增加細胞凋亡和G2/M期阻滯(P<0.05)。結論雷替曲塞能協同X線對人喉癌細胞Hep-2的抑制作用，其機制可能與誘導腫瘤細胞凋亡和增加細胞G2/M期阻滯有關。

雷替曲塞；X線；Hep-2細胞；凋亡；細胞周期

喉鱗狀細胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC)是耳鼻喉科最常見的惡性腫瘤之一。LSCC占頭頸部上皮細胞來源惡性腫瘤的第2位，具有高度侵襲性，患者5年總生存率(overall survival，OS)約為61%[1-2]。近年來，對于喉癌的治療，臨床醫師和患者越來越重視對喉部結構和功能的保護。放射治療是治療喉癌的重要手段之一。對于早期喉癌患者，根治性放療的效果與手術療效相當[3]。對于局部晚期喉癌患者，放療是手術后治療的重要手段[4]。對于無法行手術切除的喉癌患者或患者有強烈保喉意愿時，可采用放化療聯合治療[5-6]。然而，由于喉癌細胞對射線的抵抗性，往往導致放療失敗，引起腫瘤復發和轉移[7]。因此，尋找有效的放射增敏劑是多年來腫瘤領域的熱點。

雷替曲塞是與喹唑啉葉酸化學結構相似的胸苷酸合酶(thymidylate synthase，TS)的特異性抑制劑，近年應用于多種實體腫瘤。在體內，雷替曲塞可以代謝成一系列多聚谷氨酸化合物，這些代謝物具有更強的TS抑制作用[8]。由于雷替曲塞與5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-Fu)具有相似的作用機制，因此雷替曲塞的應用范圍較廣，在結直腸癌[9]、胃癌[10]、食管癌[11]、頭頸部惡性腫瘤[12]和惡性間皮瘤[13]等的治療中均取得了肯定療效。但雷替曲塞聯合放療在喉癌治療中的作用目前尚不明確。本研究通過體外實驗，探討雷替曲塞協同X線照射對喉癌細胞的抑制作用，為其臨床聯合應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑 人喉癌細胞系購自中國典型培養物保藏中心(Chinese Type Culture Collection，CTCC)。雷替曲塞由南京正大天晴制藥有限公司提供。細胞培養基MEM和胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購自美國Gibco公司。Annexin Ⅴ凋亡檢測試劑盒、細胞周期試劑盒均購自美國BD公司。CCK-8試劑盒購自日本TaKaRa公司。

1.2 細胞培養 Hep-2細胞用含10% FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的MEM培養基中，置于37℃、5% CO2、95%濕度的培養箱中培養。常規消化傳代，選取處于指數生長期的細胞進行實驗。

1.3 細胞照射 應用美國Varian直線加速器，劑量率為2 Gy/min。X線能量為6 MV，源皮距100 cm。細胞克隆集落形成實驗照射劑量依次為2、4、6、8、10 Gy，其余實驗照射劑量均為10 Gy。

1.4 細胞增殖活力的測定 在96孔板中接種指數生長期的Hep-2細胞，每孔細胞數為6×103。加入終濃度分別為0.1、0.25、0.5、1.0、2.0 μg/mL的雷替曲塞，均分別培養24、48 h，每孔加入10 μL CCK-8試劑，避光反應3 h，振勻后用酶標儀于450 nm處檢測光密度(optical density,D)值。實驗獨立重復3次。細胞活力(%)=(處理孔D-空白對照D) /(對照孔D-空白對照D)×100%。

1.5 細胞分組 將Hep-2細胞隨機分為對照組、雷替曲塞組(RTX 組)、照射組(IR組)和雷替曲塞加照射組(RTX+IR組)。根據細胞活力的檢測結果，RTX組和RTX+IR組照射前加入不影響細胞活力濃度的雷替曲塞。

1.6 細胞克隆集落形成實驗 IR組、RTX+IR組分別給予0、2、4、6、8、10 Gy的X線照射后，立即將細胞用胰蛋白酶消化，并以500～3 000個/皿[14]接種到60 mm2培養皿中。孵育14 d后，將菌落用甲醇固定，結晶紫染色。使用顯微鏡計數染色的集落數(每個集落不少于50個細胞)。實驗獨立重復3次。克隆形成率(plating efficiency，PE)=(克隆數/接種細胞數) ×100%，細胞生存分數(survival fraction，SF)=(處理組PE/對照組PE)×100%。用單擊多靶模型擬合細胞存活曲線計算各組平均致死劑量(mean death dose，D0)、準閾劑量(quasi-threshold dose,Dq)及增敏比(sensitization enhancement ratio，SER)。

1.7 細胞凋亡檢測 六孔板指數生長的Hep-2細胞分組處理同上，照射后的細胞繼續培養24、48 h，用胰酶消化并收集各組細胞(包括上清液中的細胞)，冷PBS清洗2遍，加100 μL緩沖液重懸，再加入Annexin Ⅴ和碘化丙啶(PI)溶液各5 μL，混勻，室溫避光孵育15 min后加入300 μL緩沖液，用流式細胞儀(BD FACSCalibur)進行檢測。實驗獨立重復3次。

1.8 細胞周期檢測 Hep-2細胞分組處理同上，照射后的細胞繼續培養24、48 h，用胰酶消化，收集各組細胞。將收集好的細胞用70%冷乙醇在-20℃下固定過夜，避光將細胞加入含有50 μL/mL的RNase酶和50 μL/mL PI染色液，室溫避光孵育30 min后，流式細胞儀檢測細胞周期各時相所占比例。實驗獨立重復3次。

2 結 果

2.1 雷替曲塞對Hep-2細胞增殖活力的影響 用不同濃度雷替曲塞(0.1、0.25、0.5、1.0、2.0 μg/mL)處理Hep-2細胞后，細胞活力被抑制，并呈劑量依賴性(P<0.05)；隨著時間延長細胞活力進一步下降(P<0.05，圖1)。

2.2 雷替曲塞對Hep-2細胞克隆形成的影響 雷替曲塞(0.1 μg/mL)聯合X線(2、4、6、8、10 Gy)照射后， 細胞存活分數明顯低于相應劑量的接受單純照射的細胞存活分數(P<0.05，圖2)；RTX+IR組存活曲線肩區較IR組變窄(圖2)，SERD0為1.272(表1)。

圖1 雷替曲塞對Hep-2細胞活力的影響

圖2 雷替曲塞對Hep-2細胞克隆形成的影響

表1 雷替曲塞聯合X線照射與單純X線照射組各放射參數值的比較

*外推值，細胞內關鍵靶的數目或1個靶所需擊中的次數

2.3 細胞凋亡 處理24 h后，對照組、RTX 組、IR組、RTX+IR組細胞凋亡率逐漸升高(P<0.05)；處理48 h后，對照組、RTX 組、IR組、RTX+IR組細胞凋亡率逐漸升高(P<0.05)。其中，RTX+IR組細胞凋亡率較對照組、IR組升高(P<0.01，圖3)。

2.4 細胞周期 處理24 h后，對照組、RTX組、IR組、RTX+IR組的細胞周期差異有統計學意義(P<0.05)；處理48 h后，對照組、RTX組、IR組、RTX+IR組的細胞周期差異有統計學意義(P<0.05)。其中，RTX+IR組與對照組、IR組相比，G2/M期細胞比例明顯增加(P<0.001，圖4)。

圖3 不同組別細胞處理24、48 h后凋亡率比較

圖4 不同組別細胞各細胞周期比例的比較

3 討 論

雷替曲塞為新型水溶性TS特異性選擇性抑制劑。其作用機制為：通過還原型葉酸載體(reduced folate carrier，RFC)轉運至細胞內，被葉酰多聚谷氨酸合成酶(folylpolyglutamate synthetase，FPGS)代謝為多聚谷氨酰化合物后，選擇性抑制TS，進而干擾DNA合成，導致DNA斷裂和細胞死亡，從而產生抗腫瘤作用[8]。

雷替曲塞問世早期主要用以治療結直腸癌，目前研究顯示其對多種實體腫瘤均具有抗腫瘤活性[9-13]。雷替曲塞聯合奧沙利鉑在晚期結直腸癌中較5-Fu更具優勢[15]；雷替曲塞聯合奈達鉑使晚期復發或轉移性咽喉癌患者總生存時間延長[12]；雷替曲塞聯合卡鉑對轉移或復發性頭頸鱗癌患者有效率約53%[16]。雷替曲塞不僅用于腫瘤化療，還可聯合靶向或放射治療。James等[17]進行的Ⅰ期臨床研究顯示，對于不可切除或復發性直腸癌，雷替曲塞聯合放療有顯著療效。在鼻咽癌[18]及食管鱗癌[19]中，雷替曲塞聯合放療不良反應較輕，治療效果確切。本研究通過體外實驗揭示了雷替曲塞能協同X線照射對人喉鱗癌細胞Hep-2的抑制作用。本研究中，CCK-8法檢測結果表明，隨著藥物濃度和作用時間的增加，細胞增殖活力不斷下降。與對照組相比，雷替曲塞為0.1 μg/mL時才對細胞增殖活力差異無統計學意義。故本實驗SER研究中采用此濃度。

細胞克隆形成實驗是公認的驗證腫瘤細胞放射敏感性的“金標準”[20]。本研究結果提示，雷替曲塞聯合放療能顯著減少Hep-2細胞的克隆形成數目。單純放療及聯合治療時的D0值分別為1.962、1.542 Gy，聯合治療的SER為1.272，提示在放療之前使用雷替曲塞可提高Hep-2細胞株對放療的敏感性。

細胞凋亡是放射殺死腫瘤細胞的一個重要途徑。腫瘤細胞放射敏感性與細胞凋亡密切相關，凋亡率的增加提示細胞有更大的放射敏感性[21]。本研究顯示，低濃度的雷替曲塞對喉癌細胞凋亡率沒有明顯影響，但RTX+IR組較IR組凋亡率升高。

腫瘤細胞放射敏感性在細胞周期的不同時相有很大差別，G2/M期細胞放射敏感性較G1或S期高；影響細胞周期檢測點或周期蛋白表達均會改變腫瘤細胞的放射敏感性[22]。因此，腫瘤細胞的G2/M期阻滯也是提高放射敏感性的重要途徑。本研究顯示，RTX+IR組較IR組S期細胞比例降低，并出現明顯的G2/M期停滯，提示雷替曲塞能提高喉癌細胞的放射敏感性。

放射抵抗是導致腫瘤放療失敗的關鍵因素之一，可能導致腫瘤轉移和復發。本研究通過體外實驗證明，雷替曲塞能協同X線對人喉鱗癌Hep-2細胞的抑制作用，其機制可能與誘導腫瘤細胞凋亡和增加G2/M期阻滯有關，為雷替曲塞聯合放射治療在喉癌治療中的應用提供了實驗依據。但本研究只涉及了體外研究，相關體內試驗及信號轉導通路、基因調控機制有待進一步探討。

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ThesynergisticeffectofraltitrexedcombinedwithX-rayradiationonhumanlaryngealcancerHep-2cells

WANG Shu, LI Xuan, QIAO Tian-kui*

Department of Oncology, Jinshan Hospital, Fudan University, Shanghai 201508, China

Objective： To investigate the synergistic effect of raltitrexed combined with radiotherapy on Hep-2 cells and its potential mechanism.MethodsCCK-8 assay was used to determine the cell viability after Hep-2 cells were treated with different concentrations of raltitrexed. Hep-2 cells were randomly divided into the control group, the raltitrexed group, the radiation group, and raltitrexed + radiation group. Cell survival curves were fitted with a single-hit multi-target model, cell viability and sensitization enhancement ratio(SNR) of the 4 groups were detected, and apoptosis and cycle changes of Hep-2 cells in 4 groups were detected by flow cytometry.ResultsCCK-8 assay proved that raltitrexed could suppress cell viability in a dose-dependent manner. The single-hit multi-target model showed that the SER of mean death dose (D0) was 1.272.Furthermore, the apoptosis rate and the number of Hep-2 cells at G2/M phase were significantly increased in the group treated with the combination of raltitrexed and X-ray as compared to the group treated with X-ray alone (P<0.05).ConclusionsThe inhibitory effect of raltitrexed combined with X-ray on human laryngeal cancer Hep-2 cells may be related to the induction of tumor cell apoptosis and the increase of G2/M phase arrest.

raltitrexed; X-ray; Hep-2 cells; apoptosis; cell cycle

2017-06-17接受日期2017-08-21

上海市金山區衛生和計劃生育委員會青年項目(JSKJ-KTQN-2014-01).Supported by the Jinshan District Health and Family Planning Commission Project in Shanghai (JSKJ-KTQN-2014-01).

王 抒，碩士，主治醫師. E-mail：wshu830821@163.com

*通信作者(Corresponding author). Tel：021-57039590, E-mail：qiaotk@163.com

10.12025/j.issn.1008-6358.2017.20170522

R 739.65

A

[本文編輯] 姬靜芳