肉雞MSMO1基因的克隆及表達模式分析

徐鳳華，宋 琪，邢晉祎，孫煒涵

(臨沂大學生命科學學院，山東 臨沂 276005)

肉雞MSMO1基因的克隆及表達模式分析

徐鳳華，宋 琪，邢晉祎*，孫煒涵

(臨沂大學生命科學學院，山東 臨沂 276005)

【目的】克隆肉雞MSMO1(Methylsterol monooxygenase 1)基因序列，并分析其表達模式，為研究MSMO1基因的功能奠定基礎。 【方法】利用RT-PCR技術克隆肉雞MSMO1基因，采用生物信息學方法分析其蛋白質結構，并用定量PCR技術檢測MSMO1基因在組織間的表達差異。【結果】肉雞MSMO1基因的cDNA序列長度為1404 bp，編碼296個氨基酸；MSMO1蛋白145～274 位氨基酸序列殘基存在FA-hydroxylase結構域，為親水蛋白。進化樹分析表明，肉雞MSMO1氨基酸序列與日本鵪鶉和鸚鵡的MSMO1分子親緣關系較近；二級結構主要以α-螺旋(41.89 %)為主。組織表達水平結果顯示，在8種組織中均檢測到MSMO1基因的表達，且在肝臟中的表達水平極顯著高于其它7種組織中的表達水平(P<0.01)，在脾臟和胸肌中的表達水平極顯著低于在肺臟和肝臟中的表達水平(P<0.01)。【結論】本結果將為進一步研究MSMO1基因的結構和功能奠定基礎。

肉雞；MSMO1基因；克隆；表達模式

【研究意義】甲基固醇單加氧酶1(Methylsterol monooxygenase 1，MSMO1)，又名固醇-C4-甲基氧化酶樣基因(sterol-C4-methyloxidase-like，SC4MOL)，MSMO1基因突變能引起銀屑病樣尿布皮炎、關節痛、先天性白內障和發育遲緩等病人的常染色體隱性綜合癥，該基因編碼固醇-C4-甲基氧化酶蛋白(sterol-C4-methyl oxidase)，定位在內質網膜上，在膽固醇生物合成途徑中催化C4-甲基固醇去甲基化[1-3]。因此，MSMO1基因通過調節人體能量代謝、肥胖和血脂異常，從而在脂類的生物合成中起著關鍵作用[4-6]，而且對細胞的增殖和免疫調節起著調控作用[1]。【前人研究進展】目前，人MSMO1基因被定位在4q32-q34[7]，對MSMO1基因的研究主要集中在人類膽固醇合成和脂肪代謝方面，在畜禽方面的研究尚未見報道，盡管在GenBank數據庫上已有原雞的MSMO1基因序列，但肉雞作為易于積累脂肪的動物，其MSMO1基因功能和結構尚不明了。【本研究切入點】本研究以肉雞為研究對象，克隆MSMOS1基因序列，分析MSMOS1基因序列特征及表達譜。【擬解決的關鍵問題】研究結果可為進一步研究肉雞MSMO1基因的結構和功能奠定基礎。

表1 PCR引物序列和參數

1 材料與方法

1.1 試驗動物與樣品采集

隨機挑選外形體貌和體重相近的42日齡肉雞5只。屠宰前使其空腹12 h，自由飲水。屠宰后采集胸肌、腿肌、腎臟、心臟、脾臟、肺臟、腹脂和肝臟，切割成0.5～1.0 g小塊，液氮速凍，-80 ℃保存，用于后續提取RNA。

1.2 主要儀器設備

高速冷凍離心機(Eppendorf)、凝膠成像系統、微量移液器(Eppendorf)、定量PCR儀(Roche)、高低溫振蕩培養箱、瓊脂糖凝膠電泳系統、超低溫冰箱、超純水機等。

1.3 主要試劑

Trizol Reagent和RNase Inhibitor(Invitrogen公司)、M-MLV反轉錄酶(Promega公司)、pMD19-T vector、LATaq聚合酶、EcoRⅠ、HindⅢ限制性內切酶、SYBR?Premix ExTaqTMII(寶生物工程(大連)有限公司)。

1.4 總RNA提取和cDNA合成

利用Trizol提取總RNA，并檢測RNA的質量。用Promega公司的M-MLV反轉錄試劑盒制備cDNA。

1.5 雞MSMO1基因的PCR擴增和測序

依據GeneBank上公布的原雞MSMO1(NM_001006438)基因序列，用軟件Primer premier 6.0設計引物MSMO1-f和MSMO1-r(表1)。以cDNA為模板，按照如下反應體系進行PCR擴增：10×PCR反應緩沖液(Mg2+plus)2.5 μl、模版cDNA 1.0 μl(約50～100 ng)、4種dNTP 混合物(每種2.5 mmol/L) 2.0 μl、上下游引物 (20 μmol/μl) 各0.5 μl、LATaq聚合酶0.2 μl (1 unit)、滅菌水加至25 μl，混合后稍離心。PCR反應程序：94 ℃預變性 5 min；94 ℃變性 30 s；55 ℃ 退火 30 s；72 ℃延伸 50 s；72 ℃延伸5 min。

把PCR產物進行純化回收。將pMD19-T vector與回收的PCR產物相連接，4 ℃放置過夜。制備感受態細胞，然后挑取平板上白斑單菌落，放置于含有3 mL LB培養液，3 μl Amp(質量濃度為100 μg/mL)的試管中，37 ℃恒溫搖床培養過夜，提取質粒。用Hind Ⅲ和EcoRⅠ雙酶切鑒定陽性克隆，由生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

1.6 MSMO1基因的生物信息學分析

將測序獲得的序列用 NCBI的ORF Finder程序分析MSMO1基因的開放閱讀框，預測氨基酸序列，用DNAMAN軟件比較與其它動物MSMO1的氨基酸序列一致性；采用Blast程序分析其蛋白保守結構域；用軟件MEGA 7.0構建進化樹。利用ExPASy服務器上SOSUI程序進行疏水性分析，用SOPMA程序和SWISS-MODEL工具預測雞MSMO1蛋白二級和三級結構。

1.7 MSMO1基因mRNA在不同組織中的表達模式

以胸肌、腿肌、腎臟、心臟、脾臟、肺臟、腹脂和肝臟組織的cDNA為模板，以Ex-f和Ex-r為引物(表1)，β-actin(GenBank: NM_205518)作內參，SYBR GreenⅠ為染料，利用real time PCR(qPCR)進行基因表達模式研究。qPCR反應體系： cDNA(稀釋10倍)1 μl，SYBR?Premix ExTaqTMII 10 μl，上下游引物各0.2 μl, 40個循環；3個樣本重復。用公式2-△△ct計算MSMO1基因的相對表達量。采用dps7.05軟件對MSMO1基因的相對表達量進行多重比較統計分析。

2 結果與分析

表2 不同動物MSMO1基因序列比較

2.1 MSMO1基因克隆和序列分析

利用肉雞肝臟cDNA為模板，以引物MSMO1-f和MSMO1-r擴增出1條特異帶，經測序和結果分析表明，所擴增的肉雞MSMO1基因序列長度為1 404 bp(圖1)，開放閱讀框為891 bp， 編碼296個氨基酸。克隆的序列與GenBank上登錄的序列一致性為99.57 %，僅有6 bp差異，氨基酸一致性為100 %，說明所克隆的序列為肉雞的MSMO1基因序列。所克隆的肉雞MSMO1基因核苷酸和氨基酸序列與其它物種比較，與日本鵪鶉和鴻雁的一致性較高，與大鼠和斑馬魚的一致性較低(表2)。由此推測，MSMO1蛋白在同類物種之間保守性較高。利用軟件MEGA7.0構建雞MSMO1氨基酸序列與其它物種的遺傳進化樹。從圖2可見，雞與鸚鵡和日本鵪鶉的MSMO1遺傳關系比較近。

M：DL2000 DNA marker；1～4泳道：MSMO1基因擴增產物M: DL2000 DNA marker; 1-4 lane: PCR amplification products of MSMO1, respectively圖1 雞MSMO1基因PCR產物Fig.1 PCR products of broiler MSMO1

2.2 MSMO1蛋白保守域和結構分析

2.2.1 雞MSMO1保守域分析 用Blast程序分析MSMOS1蛋白保守結構域。結果表明，肉雞MSMO1的145～274 位氨基酸序列殘基存在FA-hydroxylase結構域(圖3)。

0.02代表遺傳距離，每個節點的數字表示1000次重復后的靴帶百分比0.02 represents genetic distance, and the number at each node indicates the percentage of bootstrapping after 1000 replications圖2 雞MSMO1氨基酸與其它動物氨基酸序列進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of MSMO1 with other animals was constructed by neighbor-joining (NJ) method using MEGA 7.0

圖3 MSMO1蛋白包含保守的FA-hydroxylase結構域Fig.3 Conserved FA-hydroxylase domain of the broiler MSMO1 protein

2.2.2 MSMO1蛋白理化性質和結構分析 利用Protparam在線程序預測MSMO1蛋白相對分子質量為35 485.16 u，等電點(pI)為6.75，消光系數為90 675，脂肪指數為85.98，不穩定指數為38.69，屬于不穩定蛋白。帶正電荷的氨基酸殘基數( Arg+Lys)為24個，帶負電荷的殘基數( Asp+Glu) 為26個，因此該蛋白質可能帶負電荷。平均親水系數為-0.024， 該蛋白為親水蛋白。采用PSORTII在線軟件分析MSMO1蛋白的細胞器定位，其分布概率分別為：高爾基體4.3 %，細胞核4.3 %，細胞質17.4 %，線粒體34.8 %，內質網39.1 %。利用SignalP 4.1服務器沒有發現信號肽。用SOPMA程序預測雞MSMO1二級結構為：α-螺旋占41.89 %，延伸鏈占21.96 %，β-轉角占6.76 %，無規卷曲占29.39 %，因此MSMO1蛋白主要由α-螺旋和無規卷曲構成。利用SWISS-MODEL工具對MSMO1蛋白質進行三級結構預測，結果顯示，三級結構圖以4zr0.1.A為模板，序列一致性為20.90 %(圖4)。

2.3 MSMO1基因組織表達模式分析

利用qPCR方法對MSMO1基因在肉雞脂肪、腎臟、肺臟、脾臟、胸肌、腿肌、心臟和肝臟組織中的表達水平進行分析。結果發現，在上述8種組織中均檢測到MSMO1基因mRNA的表達，且在肝臟中的表達水平極顯著高于其它7種組織中的表達水平(P<0.01)，在脾臟和胸肌中的表達水平極顯著低于在肺臟和肝臟中的表達水平(P<0.01，圖5)。

3 小 結

通過RT-PCR方法[8]克隆得到了肉雞MSMO1基因的部分序列，長度為1404 bp，編碼296個氨基酸，并對其基因序列和蛋白結構特點進行了比較和分析；檢測了該基因在脂肪、腎臟、肺臟、脾臟、胸肌、腿肌、心臟和肝臟組織中的表達模式。研究結果將為進一步研究MSMO1基因的結構和功能奠定基礎，將豐富雞基因組數據庫。

圖4 MSMO1蛋白三級結構Fig.4 Three-dimensional model prediction of broiler MSMO1 protein

4 討 論

目前，對MSMO1基因的功能和結構的研究才剛剛開始。研究發現人類MSMO1基因有2種可變剪接，與轉錄變異體1相比，轉錄變異體2缺乏外顯子2，在人類組織中轉錄變異體1是主要的RNA同種型[9]，而在小鼠中預測到3種可變剪接(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/?term=mouse+MSMO1)，其功能還不清楚。雞是否存在可變剪接還不是太明了，尚需進一步研究。以前報道，MSMO1基因的rs17585739位點與高密度脂蛋白膽固醇相關[5]。最近，從人類MSMO1基因序列鑒定出519T→A和731A→G突變，這些突變導致氨基酸H173Q和Y244C的變化，這種變異在人群中是非常罕見的[1, 9]。也有報道，MSMO1基因內的變異與空腹胰島素和胰島素抵抗人群相關[6]。

MSMO1基因在人類組織中廣泛表達，主要高表達于肝臟、大腦、腎上腺、淋巴母細胞、皮膚、睪丸和微管組織，在培養的表皮角質形成細胞和正常的白細胞也檢測到了MSMO1基因的表達[8]。本研究表明，在所研究的肉雞8種組織中均檢測到MSMO1基因的表達，且在肝臟中的表達水平最高，與上述人類組織的表達水平一致。最近，臨床研究表明，MSMO1基因在肝結石病人肝臟中表達水平明顯增高[10]。在人Huh7肝腫瘤細胞的研究也顯示，miR-223過表達能顯著減少MSMO1基因的表達，而抑制miR-223表達卻對MSMO1基因mRNA的表達水平沒有改變[11]。另外，在人體腫瘤細胞中，脂類代謝的重要轉錄調節子PPARα和SREBP信號對話中能調節MSMO1基因的表達[12]。

圖中數據表示平均數±標準誤(n=5)，柱狀圖上不同大寫字母表示差異達到極顯著水平(P<0.01)Data are expressed as means ±std error (n=5), and the uppercase superscripts on the column show statistical difference among different tissues at 0.01 level圖5 雞MSMOS1基因的表達模式Fig.5 Expression patterns of broiler MSMO1 gene

綜上所述，對MSMO1基因的研究才剛剛起步，且主要集中在MSMO1基因缺陷對人類疾病的研究方面，尚未見對畜禽類MSMO1基因的研究報道。因此，本研究結果將為進一步研究該基因在禽類方面的功能奠定基礎。

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MolecularCloningandExpressionPatternsAnalysisofBroilerMSMO1Gene

XU Feng-hua, SONG Qi, XING Jin-yi*, SUN wei-han

(School of Life Science, Linyi University, Shandong Linyi 276000, China)

【Objective】The aims of this study are to clone broilerMSMO1 (methylsterol monooxygenase 1) gene sequences and analyze its expression patterns, which will provide a basis for further investigationMSMO1 gene function. 【Method】The broilerMSMO1 gene was cloned by RT-PCR, and the protein structure of broiler MSMO1 was predicted by bioinformatics methods, and expression patterns ofMSMO1 were assayed by real-time PCR (qPCR). 【Result】The broilerMSMO1 cDNA was 1404 bp in length, encoding 296 amino acids; MSMO1 protein of 145-274 amino acid residues sequence contained FA-hydroxylase domain, which was hydrophilicity protein. The phylogenetic tree analysis indicated that the broiler MSMO1 was closely related to the Japanese quail and parrot. The secondary structure of MSMO1 protein mainly contained alpha helix (41.89 %). TheMSMO1 mRNA were detected in all 8 tissues by using qPCR were detected, and the expression patterns in the liver were significantly higher than that in the other 7 tissues (P<0.01), and the expression levels in the spleen and breast muscle were significantly lower than that in the lung and liver (P<0.01). 【Conclusion】These results would provide the basis for the further research ofMSMO1 gene structure and function.

Broiler;MSMO1 gene; Cloning; Expression patterns

1001-4829(2017)12-2824-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.12.035

2017-01-20

山東省自然科學基金(ZR2017LC018, ZR2013CL01 2)；臨沂大學校級大學生創新創業訓練計劃(201710452032)；國家自然科學基金(31372333)

徐鳳華(1992-)，女，山東日照人，E-mail: 1697891180@qq.com， Tel: 17854278086； *為通訊作者：邢晉祎，E-mail: xingjinyi@lyu.edu.cn。

S831.2

A

(責任編輯陳 虹)