運動對大鼠紋狀體DA含量及AMPA受體亞基表達可塑性的影響

陳東方++畢妍++孫雪

摘 要：觀察中等運動強度對紋狀體內多巴胺（dopamine，DA）含量及ɑ-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸（AMPA）受體表達的影響，探求運動促進腦可塑性的機制。方法：清潔級SD大鼠62只分為4組：安靜對照組（Sham）、運動7 d組（Ex7）、運動14 d組（Ex14）和運動28 d組（Ex28）。適應性飼養1周后開始進行跑臺訓練，運動方案為11 m/min，30 min/day。采用Panlab系統觀察運動對大鼠自主活動能力的影響；采用高效液相色譜（high-performance liquid chromatography，HPLC）觀察紋狀體DA含量，采用免疫組織化學和Western-blotting觀察運動對紋狀體AMPA受體的GluR1和GluR2/3亞基表達水平的影響。結果：采用Smart 3.0軟件分析大鼠自主活動能力結果發現，長期（第14和28 d）運動訓練可以顯著增加大鼠自主活動能力（P<0.01）；HPLC結果發現Ex28組較Sham組DA含量顯著升高（P<0.01），而Ex14和Ex7組較Sham組無顯著改善（P>0.05）；免疫組織化學檢測的結果發現，長期（第14和28 d）運動干預可以顯著增加GluR1和GluR2/3亞基的表達（14 d：P<0.05，28 d：P<0.01），短期運動（第7 d）較Sham組無顯著改善（P>0.05）。結論：跑臺運動可以顯著提高大鼠的自主活動能力及紋狀體DA含量和GluR1和GluR2/3亞基的表達水平，對紋狀體神經遞質含量和受體表達產生可塑性影響。推測：DA含量提升和AMPA受體亞基表達的改變是運動提升大鼠運動表現的重要基礎之一，可能是運動改善學習記憶、認知和行為的可塑性機制之一。

關鍵詞：運動；紋狀體；多巴胺；AMPA受體；大鼠；可塑性

中圖分類號：G 804.2 文章編號：1009-783X（2017）06-0561-04 文獻標識碼：A

Abstract： Objective： To study the plasticity mechanism of moderate exercise on the brain structure， we investigated the expression of the AMPA receptor subunits （GluR1 and GluR2/3） and dopamine contents in striatum. Methods： Sixty-two adult male Sprague Dawley rats were randomly divided into four groups according to duration of treadmill exercise， namely 7 days （Ex7）， 14 days （Ex14）， 28 days （Ex28） and Sham groups. All the rats in the exercise group were forced to run on a motorized treadmill （11 m/min for 30 min each day）. As behavioral evaluations， autonomic movement were recorded by the Panlab system. After exercise， the brains were subjected to immunohisochemistry and immunoblotting to analyze changes of GluR1 and GluR2/3. Animals in high-performance liquid chromatography （HPLC） experiment group were used to test dopamine contents in striatum. Results： After exercise， the automatic movement of rats in the exercise group significantly increased in Ex14 and Ex28 compared with the Sham group（P<0.01）. HPLCresults indicated that dopamine in Ex28 group were higher than in Sham group（P< 0.01）， but there are no significant changes between Ex7 and Ex14 compared with Sham rats（P > 0.05）. There was an increased expression of GluR2/3 and a decreased GluR1 expression in Ex14 and Ex28 groups compared with the Sham group（Ex14： P < 0.05； Ex28： P < 0.01） while Ex7 groups did not（P>0.05）. Conclusion： Our research show that the exercise protocol used is able to promote plastic GluR expression and dopamine contents during exercise， suggesting a specific involvement of these receptors in exercise-induced plasticity processes in brain.endprint

Keywords： exercise； striatum； dopamine； AMPA receptor； rat； plasticity

過去的幾十年中，運動對大腦可塑性影響的研究廣泛開展。眾多基礎研究表明，運動訓練可以對正常或受損大腦神經元的結構和功能產生可塑性影響，且運動介導的腦可塑性與運動強度和運動持續時間有關[1-2]。紋狀體在運動技能學習及動作執行過程中起重要作用，多巴胺（dopamine，DA）和谷氨酸（glutamate，Glu）是調控紋狀體功能狀態的2類主要神經遞質。研究表明，DA系統是成癮和獎賞行為的重要神經基礎，運動成就和欣快感也是由DA系統介導，適宜的運動形式和強度對DA系統的可塑性影響是改善腦健康的重要機制。Glu通過與相關受體結合激活Ca2+內流引起細胞去極化，從而使胞內的酶活化產生級聯反應，該過程是腦神經可塑性產生的結構基礎之一。Glu的受體并不是突觸的靜態組件，AMPA（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionate receptor，AMPAR）受體通過與后膜的結合與分離完成信息傳遞，其亞基（GLuR1和GluR2/3）在突觸可塑性和動作技能學習方面具有直接的作用[3]。AMPA受體參與中樞神經系統的快速興奮突觸傳遞，對正常的腦功能維持起著重要作用[4-5]，其亞基表達的改變是突觸可塑性發生的結構基礎，這可能是運動影響學習記憶、認知和行為的可塑性機制之一[6]。紋狀體DA減少或AMPA受體亞型表達的病理改變是許多神經退行性疾病的發病基礎，二者的可塑性改變可能是運動促進腦健康的機制之一。作為運動干預介導可塑性的重要作用靶點，DA含量與AMPA受體表達的改變與運動促進腦健康的神經機制密切相關。為此，本研究采用HPLC和免疫組織化學及免疫印跡的方法，分別觀察了不同運動持續時間的中等運動強度對大鼠紋狀體DA含量及AMPA受體亞基（GluR1和GluR2/3）表達的影響，探求運動訓練促進大腦可塑性的可能機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及材料

實驗選用健康雄性Sprague-Dawley大鼠，體質量220～240 g，由北京大學醫學部實驗動物科學部提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（京）2011-2012。大鼠在標準環境中分籠飼養，適應性飼養1周后，隨機分假手術安靜組（Sham，n=14）、7 d運動組（Ex7，n=16）、14 d運動組（Ex14，n=16）和30 d運動組（Ex28，n=16）。

1.2 運動干預方案

采用Tajiri [7]等提出的中等強度勻速跑臺運動方案，大鼠執行該強度時心率為65%～75% 的最大心率。運動方案為：11 m/min，30 min/day[7]。實驗設計如圖1所示。

1.3 行為學測試

采用Panlab系統進行自主能力測試實驗，用于評估大鼠的運動能力。每只大鼠放于直徑50 cm的實驗箱的中央，讓大鼠自由活動5 min，攝像頭同步記錄其在箱體的活動。采用Smart 3.0 軟件分析5 min內大鼠自主活動時間、靜止時間和精細動作時間所占比例。參照Alexxai [8]行為學實驗，自主活動時間是指動物平均中心速度大于2 cm/s且持續時間超過0.5 s；靜止時間是指動物靜止的時間不小于1 s；精細動作時間包括理毛、站立等特殊精細行為。

1.4 免疫組化實驗

各組大鼠在實驗結束后的第2 天，用10%的水合氯醛（3.5 mL/kg）腹腔注射麻醉，灌流取腦，腦組織置于4%多聚甲醛中固定12 h。固定好后分離紋狀體，梯度酒精脫水、二甲苯中透明2次，石蠟包埋備用。蠟塊連續冠狀切片，每6張選1張，片厚5 μm。順序貼片、烤片、脫蠟及水化。PBS沖洗、抗原修復后滴加3%雙氧水在載玻片上，封閉20 min，加入GluR1和GluR2/3的一抗（1∶100，Chemicon，Temecula，CA，USA）4 ℃孵育過夜，37 ℃復溫20 min，PBS沖洗，加入二抗（1∶200，Proteintech Group，USA），室溫孵育1 h，PBS沖洗3次。DAB顯色劑染色，PBS沖洗后采用蘇木素復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。采用奧林巴斯顯微鏡對紋狀體背外側區域拍照。采用Image-Pro Plus 6.0軟件對免疫陽性細胞計數。

1.5 Western blot

各組大鼠在試驗結束后的第2 天，斷頭取腦，于冰上快速分離紋狀體，置于-80 ℃的冰箱。檢測時取出組織置于預冷的研缽體中碾碎，轉入EP管，加入組織裂解液，勻漿后離心，取上清液樣品，測定總蛋白含量，另取上清液 樣品置于-80 ℃冰箱保存。樣品經10%SDS-PAGE膠分離后，經4 ℃、18 V恒壓1 h；在一抗溶液中4 ℃孵育過夜，漂洗后在HRP標記的二抗溶液中室溫孵育60 min，β-actin作內參。ECL檢測膠帶，X光膠片曝光、沖洗。將膠片進行掃描，用凝膠圖像處理系統分析目標帶積分光密度值（IOD）。

1.6 紋狀體DA含量高效液相色譜-電化學聯測法檢測

所有實驗結束后24 h，用10%水合氯醛（4.5 mL/kg）腹腔注射麻醉，斷頭取腦，準確稱量紋狀體質量，以1∶9（體積分數）加入生理鹽水，玻璃勻漿器冰浴勻漿，離心取上清液，以1∶2（體積比）加入0.4 mol/L高氯酸去蛋白，低溫下取上清液，加入碳酸鉀溶液稀釋后低溫離心，取上清液，加入衍生劑，混勻待測。

標準溶液的配制：精確稱取DA 0.5 mg→用dd H2O稀釋至0.5 mL→制成1 μg/μL的貯備液→取10 μL，加流動相990 μL稀釋→10ng/μL的貯備液→取40μL，加流動相稀釋至500 μL→用流動相倍比稀釋得6個濃度梯度：8、4、2、1、0.5 ng/20 μL。色譜條件：色譜柱為ODS-SP反相色譜柱（4.6×150 mm，5 μm），流動相：V（甲醇）∶V（雙蒸水）=1∶9，其中ddH2O中每升含NaH2PO4 0.1 mol/L，EDTA·2Na（2H2O） 0.027 mmol/L，辛烷磺酸鈉0.74 mmol/L，Kcl 2 mol/L；流速為0.25 mL/min，柱溫為35 ℃，調節PH為3。上樣分析，繪制標準曲線及含量計算：1）設定ECD電壓為0.65 V， 樣品流量1.0 mL/min，每一樣品檢測時間為35 min；2）將標準品依次進樣，檢測并且記錄其保留時間作為定性指標；3）將5種濃度的標準品混合并稀釋，然后依次進樣，檢測并繪制標準曲線，求出直線回歸方程，得出相應含量。endprint

1.7 數據處理

應用sigmaplot 13.0統計軟件對所得數據進行統計學計算，數據以平均值±標準差表示，各組間比較采用雙因素方差分析（Two-Way ANOVA），組間多重比較采用LSD檢驗，顯著水平為P<0.05。

2 結果

2.1 自主活動能力測試結果

自主活動能力測試結果顯示：與Sham組相比，Ex7和Ex14組的大鼠靜止狀態和精細動作所占時間比例沒有顯著性改變（P>0.05）；但Ex14組大鼠的自主活動時間所占時間比例顯著升高（P<0.05），而Ex28組，大鼠自主活動和精細動作的時間所占比例顯著升高（P<0.01，P<0.05），靜止狀態的時間顯著降低（P<0.01），如圖2所示。

2.2 免疫組化結果

免疫組化結果顯示如圖3所示：與Sham組相比，Ex14和Ex28組的紋狀體GluR1表達均上調，差異具有顯著性（Ex14組P<0.05，Ex28組P<0.01）；而Ex7組的表達沒有顯著性差異（P>0.05）。與Sham組相比，Ex14和Ex28的GluR2/3的表達顯著上調，差異具有顯著性（Ex14組P<0.05，Ex28組P<0.01）；而Ex7組的表達沒有顯著性差異（P> 0.05）。

2.3 Western-blotting 結果

Western-blotting結果顯示，Ex7組的紋狀體GluR1與GluR2/3的表達與Sham組相比均無顯著性差異（P>0.05）；而與Sham組相比，Ex14與Ex28組的紋狀體GluR1和GluR2/3的表達水平均顯著上調，且差異具有顯著性（Ex14組P<0.05，Ex28組P<0.01）。Western-blotting的結果顯示，各組大鼠GluR1和GluR2/3的免疫組織化結果趨勢一致。

2.4 大鼠紋狀體內DA含量變化

各組大鼠紋狀體內DA水平如圖5所示，與Sham組相比，Ex7和Ex14組紋狀體內的DA水平均無顯著性改變（P>0.05），而Ex28組的DA水平顯著升高（P<0.01）。

3 討論

紋狀體是基底神經節最大的信息輸入核團，它接受來自黑質DA能及皮層和丘腦的Glu能的投射，DA是兒茶酚胺類神經遞質的一種，它參與認知、情感、內分泌等多種功能的調控[9]；皮層-紋狀體Glu的神經傳導被證實是習慣化運動和目標運動技能形成的神經環路[11-12]。紋狀體是腦內DA含量最高的結構，其DA含量占全腦的70%～80%，紋狀體內DA水平與運動學習能力密切相關，有研究證實腦內DA水平增高可增強運動控制的神經元活性，促進耐力性運動成績的提高[13-14]。DA系統參與技能學習與動作執行，DA對行為功能的影響存在不同胞內信號控制路徑，DA與D1型受體結合可異化運動，與D2型受體結合可拮抗運動并減少多余動作。AMPA受體亞基表達改變調節參與運動技能學習相關的突觸可塑性，皮層-紋狀體突觸后AMPA受體亞基表達改變對突觸快速興奮性傳導效率（即突觸傳遞的可塑性）起決定性作用[15-17]。AMPA受體亞基在Glu的突觸傳遞過程中起著重要作用，其中GluR2/3在正常情況下控制Ca2+內流量，在病理狀態下如帕金森病，GluR2/3的表達量下降，導致流入紋狀體神經元胞內的Ca2+增多，會引起級聯的興奮性毒作用，GluR2/3介導的興奮性毒作用被認為是帕金森病發病機制的一種[11-12]。

許多研究表明，運動可以通過促進大腦代謝水平，刺激神經的發生，從而改善正常或病理（如腦卒中或神經退行性病變）狀態下的行為功能[10，15-16]。Van等的研究發現，自主跑輪運動可以促進海馬神經元的發生，增強突觸可塑性，是運動記憶增強的神經基礎[17]；Molteni等[1]的研究發現，跑臺運動增強動物技能學習的同時伴隨著皮層-紋狀體Glu傳導的改變；Tajiri等[7]采用中等強度跑臺早期干預帕金森病模型大鼠發現可以減少黑質-紋狀體DA的損耗，加強對大腦的神經保護作用。VanLeeuwen等[18]采用高強度間歇跑臺運動強迫帕金森病模型小鼠訓練，4周后發現AMPA受體GluR2/3的表達相較于病理狀態顯著下調，AMPA受體可能是運動改善帕金森病模型行為功能的腦內作用靶點。研究發現長期有氧運動可增加中腦及紋狀體DA含量，與運動技能學習的提升密切相關[19]。紋狀體內DA和Glu遞質平衡對正常運動執行至關重要，紋狀體主要參與運動的順序學習和運動后期動作的自動發起[20]。本研究發現：Ex28組大鼠較對照組紋狀體DA含量增高的同時伴隨自主活動能力的增強，這與前人研究發現運動促進DA分泌、提高自主活動能力相一致；同時Ex7組較Control組沒有顯著差異，表明運動對DA含量的影響存在時間依賴效應。Ex14與Ex28組較Control組GluR1和GluR2/3亞基的表達量均有增加，提示亞基的表達與后期運動學習的突觸可塑性有關這與Smith等的研究結果一致[21]。本研究進一步證實，紋狀體DA和AMPA受體亞基是運動介導腦可塑性的重要作用靶點，DA含量提升和AMPA受體亞基表達的改變是運動提升大鼠運動表現的重要基礎之一，可能是運動改善學習記憶、認知和行為的可塑性機制之一。

4 結束語

跑臺運動可以顯著提高大鼠的自主活動能力及紋狀體DA含量和GluR1與GluR2/3亞基的表達水平，對紋狀體神經遞質含量和受體表達產生可塑性影響。推測：DA含量提升和AMPA受體亞基表達的改變不僅是運動提升大鼠運動表現的重要基礎之一，而且可能是運動改善學習記憶、認知和行為的可塑性機制的重要因素。

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