一株高效解磷青霉菌株的篩選與鑒定

劉春菊+王彩霞+張玉芹+杜傳印+梁子敬+于金鳳

摘要：采用以Ca3（PO4）2作為唯一磷源的無機磷固體培養基對實驗室保存的青霉菌株進行解磷作用初篩，并以Ca3（PO4）2作為磷源的液體培養基對初篩菌株的解磷能力進行定量測定分析，然后對篩選出的高效解磷青霉菌株進行形態學和分子生物學鑒定。定量分析結果表明，初篩青霉菌株中QM-10解磷能力最強，隨著培養時間增加，液體培養基中可溶性磷含量先增加后降低并趨于穩定，振蕩培養96 h后，培養液可溶性磷含量最高，為1 386.93 mg/L；培養過程中pH值先降低后趨于穩定，對應最小pH值為2.09。形態學和分子鑒定結果表明，QM-10為草酸青霉（Penicillium oxalicum）。

關鍵詞：高效解磷青霉菌株；解磷能力；可溶性磷含量；鑒定

中圖分類號：S154.38文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2017）12-0050-04

Abstract Using the medium with Ca3（PO4）2 as the sole phosphorus source to screen the phosphate solubilizing ability isolates of Penicillium strains which were stored in laboratory. In order to obtain the strains with the highest phosphate-solubilizing capacity， the first selected Penicillium strains were individually inoculated into the liquid medium containing Ca3（PO4）2 as the sole phosphorus source to quantitatively analyze their phosphate solubilizing ability. The results showed that the QM-10 strain had the highest ability of phosphorus solution. With the increase of incubation time， the soluble phosphorus content increased firstly， then decreased and finally tended to stabilize. After 96 hours of concussion culture， the soluble phosphorus content in the culture solution of QM-10 was the highest as 1 386.93 mg/L.The pH value of its culture solution first decreased and then tended to be stable，corresponding to the minimum value as 2.29. The morphological and molecular identification confirmed that QM-10 strain belonged to Penicillium oxalicum.

Keywords Phosphate-solubilizing Penicillium strains；Phosphate-solubilizing capability； Soluble phosphorus content； Identification

磷是植物生長發育所必需的礦質元素之一，對促進植物的生長發育和新陳代謝具有重要作用[1]。為提高農作物的產量和品質，農民每年向土壤中施入大量磷肥。但由于土壤礦物質對磷元素具有很強的吸附和固定作用，大部分磷與土壤中的Ca2+、Fe2+、Fe3+、Al3+結合形成溶解性較差難以被植物吸收利用的磷酸鹽[2]，導致施入磷肥的當季作物利用率僅為5%～25%。因此，如何有效提高磷肥的利用效率，是目前農業生產中亟待解決的問題。

土壤中存在著細菌、真菌和放線菌等多種解磷微生物，它們通過自身的生命活動，將土壤中不溶性磷轉變為可溶性磷，一方面供植物生長發育需要，另一方面提高植物對施入土壤的磷肥利用效率。目前，國內外已報道的解磷微生物中，解磷細菌的種類、數量較多，但研究表明真菌的解磷能力比細菌要強幾倍或10倍以上[3]。1952年Johnson首次探索了真菌解磷效果，并且報道Aspergillus niger具有較強的解磷能力[4]。目前報道的解磷真菌主要有青霉（Penicillium）、曲霉（Aspergillus）、根霉（Rhizopus）、鐮孢菌（Fusarium）等，其中研究較多的是黑曲霉（Aspergillus niger）和青霉（Penicillium）[5]。Acevedo報道了兩株高效解磷真菌（Aspergillus和Penicillium）的解磷能力分別能達到82%和80%[6]。

本試驗使用無機磷培養基對實驗室保存的180株青霉菌進行解磷能力初篩，再用無機磷液體培養基對初篩菌株進行培養并測定菌液的可溶性磷含量、pH值，從中選擇解磷效果較好青霉菌株，并對這個菌株進行形態學鑒定和分子鑒定，為今后研究和開發相應的微生物菌劑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

菌株：實驗室保存的180株青霉菌，分離自山東濰坊煙株根際土壤和山東棲霞、蓬萊、昌邑，遼寧大連、金州、秦皇島，河北滄州等渤海灣果園土壤；其中QM-10分離自山東蓬萊地區的果樹根際土壤。

培養基：馬鈴薯葡萄糖培養基，用于青霉菌株的培養；以Ca3（PO4）2作為唯一磷源的無機磷固體培養基和液體培養基，用于供試菌株解磷能力定性及定量測定[7]。endprint

1.2 試驗方法

1.2.1 解磷青霉的初篩 取活化后青霉菌株接種于無機磷固體培養基上， 28℃恒溫培養7 d，測定菌落直徑（d）、解磷圈直徑（D），重復3次。根據解磷圈直徑與菌落直徑比值（D/d）初步確定各菌株解磷能力[8]。

1.2.2 解磷能力定量測定 按照魏景超[10]研究方法制作磷標準曲線，得出回歸方程，計算菌株的解磷量。將初篩具有一定解磷能力的青霉菌株孢子分別刮入無菌水中，于28℃、160 r/min條件下，搖床振蕩培養30 min，使孢子充分散開，制備成菌懸液，用移液槍吸取孢子懸浮液置于血球計數板進行計數，最終得到濃度為108 cfu/mL的孢子懸浮液。按1%接種量將孢子懸浮液接種于100 mL無機磷液體培養基中，28℃、180 r/min搖床振蕩培養，分別在0、24、48、72、96、120、144、168 h取上清液，按照鉬銻抗比色法[9]測定可溶性磷含量，采用pH計（賽多利斯pH計，PB-10）測定pH值。

1.2.3 菌株鑒定 形態特征觀察測定參照《真菌鑒定手冊》[10] 和《中國真菌志（第三十五卷）》 [11]青霉屬及其相關屬的鑒定方法進行；分子生物學鑒定按照參考文獻[12]中的方法進行。

1.3 數據統計分析方法

采用DPS數據處理系統軟件對數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 高效解磷青霉菌株的初篩

根據解磷圈直徑與菌落直徑比值（D/d）的大小，初步篩選到6株具有解磷效果的菌株（詳見表1），其中QM-10、QM-6、QM-4-1解磷效果較好，D/d分別為1.47、1.33和1.27。

2.2 高效解磷青霉菌株的復篩

由表2可見，青霉菌株QM-10對Ca3（PO4）2的溶解效果最好，其對應的最大可溶性磷含量為1 386.93 mg/L，此時對應的pH值為2.09。

2.3 高效解磷青霉菌株的解磷能力定量測定

菌株QM-10在液體培養基中振蕩培養（圖1），隨培養時間的延長，培養液中可溶性磷含量先增加后降低并趨于穩定，培養0～24 h時變化不是很明顯，培養至24～96 h時可溶性磷含量急劇增加，且在96 h時達到最大值；培養基初始pH為6.9，在培養過程中，pH值均有所降低，后趨于穩定。可見pH值大小與菌株最大可溶磷含量基本呈反比，即可溶性磷含量越高，對應的pH值越小。

2.4 高效解磷青霉菌株的形態學鑒定

菌株QM-10在PDA培養基上菌落平坦，質地絨狀，菌落正面墨綠色，反面淡黃色（培養168 h），邊緣厚密（圖2）。分生孢子易脫落，產生大量分生孢子。隨培養時間延長，菌落表面孢子堆積成殼狀，有滲出液出現。

顯微鏡觀察結果顯示，該菌株具有青霉屬典型的帚狀枝（圖3B），分生孢子梗通常雙輪，偶有三輪或單輪，梗基彼此較緊貼；瓶梗每輪5 ～ 8 個或更多；分生孢子形態近圓柱狀，梗頸通常明顯，壁平滑。這些形態特征與草酸青霉（Penicillium oxalicum）的描述性狀相符合。

2.5 高效解磷青霉菌株的分子鑒定

以 ITS1 和 ITS4 為引物，對菌株QM-10的基因組DNA進行PCR擴增，得到500～750 bp左右條帶（圖4）。將測序結果與GenBank中已提交序列比對、進行同源性分析，利用軟件MEGA 5.0，以部分Penicillium sp. 菌株為基礎構建5.8S rDNA基因進化樹（圖5），發現菌株與草酸青霉菌株NJDL-03（KT354504.1）的相似性為 100%。

根據以上分生孢子特征，參照《真菌鑒定手冊》[10]和《中國真菌志（第三十五卷）》[11]青霉屬及其相關有性屬，確定菌株QM-10為草酸青霉（Penicillium oxalicum）。

3 討論與結論

平板解磷圈法和液體培養法是研究微生物解磷能力最常用的兩種方法，本研究利用這兩種方法篩選到一株高效解青霉菌株 QM-10，結合菌體形態特征、ITS序列分析等研究方法，最終將菌株QM-10 的分類地位明確為草酸青霉（Penicillium oxalicum）。

關于微生物解磷能力與培養介質pH值之間的關系，有人認為培養基的pH值與解磷量的相關性不明顯[13]，也有人認為培養基中pH值與解磷微生物的解磷能力具有很明顯的相關性[14，15]，即培養介質的pH值越低，培養液中的可溶性磷量越大，表明培養介質的酸度對溶磷量有很大影響。本研究中，菌株QM-10上清液的 pH值與可溶性磷含量存在一定負相關性，基本是可溶性磷含量越高，對應的pH值越小，與Vassilev等[14]的研究結果相似。

分泌有機酸，使pH 值降低，溶解難溶性磷，增加可溶性磷含量，是微生物解磷的重要機制之一。結合微生物解磷機理分析，可能是在培養過程中菌株QM-10產生有機酸與復合磷酸鹽中的鈣結合形成穩定的可溶性復合物，進一步溶解土壤中的難溶性磷酸鹽。但在培養過程中可溶性磷含量會在某一時刻達到最大值，卻不會隨著時間的延長而一直增加，可能因為：①培養基中已有的可溶性磷含量會抑制對磷酸鈣的進一步溶解；②碳源的消耗會限制有機酸的產生及青霉的活動[16]。

參 考 文 獻：

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