植物代謝組學研究進展

郭鳳丹+王興軍+侯蕾+趙術珍+厲廣輝+夏晗

摘要：代謝組學是一門新興的交叉學科，是系統生物學的重要分支，目前已被廣泛應用于動物、植物、微生物等研究領域。本文簡要介紹了代謝組學的檢測技術及數據處理方法，概述了代謝組學在植物代謝途徑以及代謝組遺傳基礎研究中的進展，包括不同植物材料、不同環境條件尤其是逆境脅迫下的代謝譜分析以及代謝相關QTL定位、功能基因鑒定等，分析了代謝組學發展過程中的問題，并對其應用前景進行了展望。

關鍵詞：植物；代謝組學；研究方法；代謝譜；遺傳基礎；進展

中圖分類號：S188：Q781文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2017）12-0154-09

Abstract Metabolomics is an important branch of system biology and has been widely used in studies of plants， animals and microorganism. In this article， the detection technologies and data processing methods of metabolomics were introduced briefly. The research progresses of metabolomics in understanding plant metabolic pathways and genetics of metabolome were summarized， including metabolic profiling of different plant materials under different environmental conditions especially the stress conditions， mQTL mapping and identification of functional genes. The problems present in the metabolomics studies were also discussed， and the prospective application metabolomics was previewed.

Keywords Plant； Metabolomics； Research method； Metabolic profiling； Genetic basis； Progress

近年來，組學技術成為探索生命奧秘的重要手段，繼基因組學、轉錄組學和蛋白質組學之后，代謝組學也迅速發展起來，成為系統生物學的一個重要組成部分。它旨在對生物體組織或細胞特定時期下的全部小分子代謝物質進行定性和定量分析，主要反映生物體的生理和生化狀態[1]。傳統的代謝概念包括合成代謝和分解代謝，代謝產物也包括中間代謝產物和最終代謝產物，因此廣義上的代謝物應包括所有參與生物體內生命活動的分子。但為了有別于基因組、轉錄組和蛋白質組，代謝組目前只涉及相對分子質量約小于1 000 D的小分子代謝物質[2]。

隨著現代分析技術的不斷改進、數據庫的積累和生物信息學的發展，代謝組學得到快速發展，已被廣泛應用于動物、植物和微生物等諸多研究領域[3]。植物內源代謝物種類繁多，總數有20萬～100萬種[4]，對生命過程中這些代謝物進行全面的定性定量研究，對于后基因組時代全面認識植物生命活動十分必要[5]。代謝組學旨在發掘生命現象的分子結果，豐富組學研究內容，通過與其他組學技術整合，將生命過程和結果有機結合分析，在功能基因鑒定、代謝途徑解析及自然變異的遺傳結構分析等方面發揮著越來越重要的作用。本文簡要綜述了代謝組學研究方法及在植物代謝規律和遺傳基礎研究中的進展。

1 植物代謝組學研究方法

植物代謝組學分析一般包括試驗設計、植物栽培及取樣、樣品制備和預處理、代謝產物的分離和鑒定、數據的分析和解釋。由于植物代謝物尤其是次生代謝物種類繁多、結構迥異，根據研究對象及目的不同，代謝組學分析的具體步驟會有所不同，采用的分離鑒定手段及數據分析方法也會各不相同。

植物代謝物的種類和含量除受遺傳及環境因素影響外，還與樣品的提取制備過程關系緊密。為了獲得穩定的試驗結果，樣品制備需要考慮試驗材料的生長、取樣的時間和地點、取樣量及樣品的處理方法等問題。為真實反映代謝產物在植物體內的存在信息，采集樣品后需立即阻斷材料內在酶的活性，通常采用冷凍/液氮降溫法保存材料，抑制代謝反應的進一步發生，待使用時取出均質粉末[6]。代謝產物提取和分離的方法要根據目標組分的分子結構、溶解性、極性等理化性質以及所選用的分析技術進行選擇，通常選用的萃取溶劑為水或甲醇、乙醇、異丙醇、氯仿、乙腈、己烷等溶劑。在代謝物分析之前，通常先用固相萃取、固相微萃取、親和色譜等方法進行預處理[7]。

代謝組分析技術包括代謝物的分離、檢測及鑒定。目前，代謝產物的分離技術主要有氣相色譜（gas chromatography， GC）、液相色譜（liquid chromatography， LC）和毛細管電泳（capillary electrophoresis， CE）等。檢測及鑒定技術主要有質譜（mass spectrometry， MS）、核磁共振（nuclear magnetic resonance， NMR）、庫侖分析、傅立葉變換-紅外光譜（FT-IR）、紫外吸收、熒光散射、發射性檢測和光散射等。分離技術與檢測技術的不同組合就形成了不同的代謝組學分析技術。目前，常用分析手段是核磁共振，氣相色譜、液相色譜、毛細管電泳與質譜聯用等。

針對代謝物組學分析技術，2010年之前主要瓶頸在于可以鑒定的代謝物種類較少，通常在100種以內，這就使組學價值大打折扣。隨著技術發展，現在的代謝組學實測可以達到300種代謝物以上。迄今，還沒有一種代謝組學分析方法能夠涵蓋所有的代謝物，多種分析平臺聯合使用是對單一分析技術的補充，以達到對不同極性代謝物的廣譜分析。

針對核磁共振技術新開發的魔角旋轉（magic anglespinning，MAS）[8]、磁共振成像（magnetic resonance imaging， MRI）和活體磁共波譜（vivo magnetic resonance spectroscopy， MRS）[9]等技術進一步促進了核磁共振在材料活體部位代謝組分析中的應用。質譜技術有直接進樣和色譜-質譜聯用兩種方式。傅立葉變換-離子回旋共振-質譜（fourier transform-ion cyclotron resonance-mass spectrometry，FT-ICR-MS）、飛行時間質譜（time of flight-mass spectroscopy，TOFMS）、軌道阱質譜（orbitrap）等適合于直接進樣的質譜分析技術得到了發展，在未知化合物的確定上發揮了很大作用[10]。另外，電噴霧萃取電離（extractive electrospray ionization， EESI）、實時直接分析（direct analysis in real time， DART）、解析電噴霧離子化（desorption electrospray ionization， DESI）等新型離子化技術的發展也促進了直接進樣質譜在代謝組學中的應用[11]。針對色譜-質譜聯用技術，二維氣相色譜（GC×GC）-質譜（MS）聯用[12]和二維液相色譜（LC×LC）-質譜（MS）聯用技術[13]提升了代謝物分離效率，增加了峰容量，提高了檢測靈敏度，從而擴展了代謝譜的分析范圍。親水相互作用色譜（hydrophilic interaction liquid chromatography， HILIC）技術的出現改善了強極性和強親水性小分子物質的分離狀況，已廣泛應用于代謝組學研究[14]。此外，微流體色譜（microfluidics）和超臨界流體色譜（supercritical fluid chromatography， SFC）等新型色譜技術以其強大的分辨能力，將進一步促進代謝組學研究的發展[15，16]。

代謝組學通過儀器分析得到的數據是一個龐大的多維矩陣，為了充分獲取數據中的潛在信息，常用化學計量學中的模式識別方法對原始數據進行降維和歸類處理，將其轉變為適合多變量分析的數據形式。常用的模式識別方法主要有無監督方法（unsupervised method）和有監督方法（supervised method）兩種。無監督方法應用最多的有主成分分析（principal components analysis， PCA）、自組織映射（self-organizing mapping， SOM）、非線性映射（non-linear mapping， NLM）、系統聚類分析（hierarchical cluster analysis， HCA）等。有監督方法主要包括偏最小二乘法（partial least squares， PLS）、線性判別分析（linear discrimination analysis， LDA）、偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA）和人工神經元網絡（artificial neural networks， ANN）等。

代謝組學建立數學模型的目的是為了從海量數據中提取有用的生物信息，篩選出在生理、病理或逆境響應中重要的生物標記物。而獲取信息的前提是利用生物信息學對未知代謝物進行結構鑒定或注釋[17]。近年來，建立了一系列公共代謝組學數據庫資源，如MassBank （http：//www.massbank.jp/）、KEGG COMPOUND （http：//www.genome.jp/kegg /compound/）、KNApSAcK （http：//kanaya.naist.jp/KNApSAcK/）、Plant metabolome database （PMDB） （ http：//www.sastra.edu/scbt/pmdb/）、LipidMaps （http：//www.lipidmaps.org/），以及整合了四大小分子數據庫KEGG、HMDB、Lipid Maps、BioCyc的新的統計分析程序MetaboLyzer[18]。

盡管目前國內外在代謝組學研究平臺及技術開發方面取得了不少進展，但仍無法滿足代謝組學研究的需要，還需繼續開發高效可靠的研究方法及技術手段。

2 植物代謝組學研究進展

植物代謝物分為兩大類，初生代謝物和次生代謝物。初生代謝物為維持植物生長發育和生命活動所必須，次生代謝物則更多地參與植物抗病、抗逆等環境因子應答。在植物生長發育過程中，任何內外因素的影響都可能引起植物代謝物含量或代謝流的變化。由于代謝物處在植物系統生化活動的末端，反映的是已經發生的生物學事件，所以相對于其他組學，代謝組學更能反映植物體的生理和生化狀態，因此被越來越廣泛地應用于植物生物學及相關領域的研究中。代謝組學在植物中的應用主要集中在兩個層面，一是代謝譜分析，包括不同基因型、不同生態型植物的代謝產物比較，代謝途徑研究，不同環境條件對代謝物的影響以及抗逆代謝組學研究等；二是遺傳代謝組學（genetical metabolomics），即用來解析植物代謝的遺傳基礎，包括代謝相關QTL定位、功能基因鑒定及代謝途徑解析等。

2.1 不同植物材料的代謝組分析

對不同基因型材料間尤其是突變體或基因改造植物與野生型材料間的代謝產物進行比較，對于篩選優良品種或基因、評價基因改造效果及進行功能基因組學研究有重要意義。Mumm等[19]采用6個代謝組學平臺對31種不同基因背景及來源稻米的代謝產物進行檢測，發現茉莉香米（jasmine）和印度香米（basmati）存在代謝上的差異，對于解釋稻米改良育種過程中稻米質量、生化組成和基因型之間的潛在聯系提供了新的研究思路，并為稻米品種改良提供種質材料及技術路線。為了解稻米直鏈淀粉含量與米粒外觀、淀粉顆粒結構等表型特征的關系，Kusano等[20]采用基于質譜的代謝組學對五種不同直鏈淀粉比例的粳稻和兩種基因敲除突變體粳稻的代謝物變化進行分析，為水稻育種相關代謝性狀及其潛在遺傳基礎研究提供了有用信息。Chen等[21]利用GC/LC-MS對擬南芥硫苷合成酶基因CYP79F1的兩個RNAi株系進行代謝組學分析，發現一些氨基酸、糖類、多肽和激素等代謝產物發生變化，同時通過蛋白質組學分析對結果進行驗證，兩組數據對于進一步了解擬南芥硫苷代謝的分子調控網絡及后續增強植物抗性和質量奠定了基礎。

除了不同基因型，利用代謝組學技術對同一植物不同發育時期或不同組織器官的代謝物種類和含量進行研究也具有重要意義。Aharoni等[22]采用FT-MS對草莓果實成熟過程中一系列代謝產物的動態變化過程進行非靶向代謝組學分析，從而對草莓的成熟機制有了進一步了解。Park等[23]采用GC/MS方法對不同栽培年限的人參根部樣品進行代謝組學分析，結果顯示，人參環氧炔醇（panaxydol）和人參炔醇（panaxynol）含量隨栽培年份增加而升高，可以作為鑒別人參年限的關鍵組分。賈巖等[24]采用基于NMR的代謝組學技術對不同發育階段的款冬花（Tussilago farfare）次生代謝物的合成規律進行分析，并聯合高通量轉錄組學篩選關聯酶基因，為款冬花次生代謝物的生物合成調控研究奠定了基礎。Ahmad等[25]采用GC/MS對馬來西亞重要的油料作物小蓼（Polygonum minus）根莖葉中的揮發性代謝組分進行分析，發現癸醛和月桂醛是其香氣的主要貢獻者，且三帖化合物在葉中大量富集，為小蓼揮發性組分植物化學譜（phytochemical profiles）的研究奠定基礎。

2.2 不同生境下植物代謝組研究

植物代謝過程尤其是次生代謝過程及代謝物的富集受環境中各種生物和非生物因素的影響，利用代謝組學研究不同生境下植物代謝產物的差別，不僅能夠深入了解植物與環境的相互作用，還能揭示植物表型與生長發育及生物多樣性的關系。這類研究常用于藥用植物鑒別和質量控制。

我國藥材種類繁多，來源復雜，中藥基原品種的真偽、正宗與否，直接關系到藥材療效，即使同一種藥材，產地及自然條件不同，藥材的產量和質量也不相同，臨床療效也有較大差異，因此有“道地藥材”的說法。代謝組學分析可廣泛應用于中藥基原品種鑒定及不同生態型不同產地藥材的品質鑒定與質量控制。傳統中藥柴胡有兩種來源，分別是柴胡Bupleurum chinense D.C.和狹葉柴胡B. scorzonerifolium Willd.，俗稱“北柴胡”和“南柴胡”，傳統的色譜分析方法均不能對兩者進行準確區分，Qin等[26]采用基于1H-NMR的代謝組學找到了區分兩個種的標志物，體現了1H-NMR代謝組學在中藥種類鑒別及質量評價中的獨特優勢。沙棘是典型的多基原藏藥，劉悅等[27]采用1H-NMR代謝組學結合DNA條形碼技術發掘了3種沙棘遺傳和生化特征的差異性，能對3種沙棘進行準確鑒定。韓正洲等[28]采用UPLC-Q-TOF/MS技術對栽培型和野生型野菊花的整體代謝物組成進行比較分析，發掘了可以區分兩種野菊花的特征性化學成分，為其質量評價提供了有效手段。鄭文等[29]采用UPLC-Q-TOF/MS技術對不同產地來源的蟲草化學成分進行鑒定分析，發現不同產地的蟲草在有效成分種類和相對量上存在一定差異，其中西藏產的蟲草質量最高，說明代謝組學技術可用于蟲草藥材的真偽、產地、品質等的評價。另外，由于藥用植物的活性成分多為次生代謝產物，基于次生代謝和生態環境的密切相關性，有學者提出通過選擇具有一定環境壓力的次適宜生態環境來解決藥用植物栽培中生長和次生產物累積的矛盾的觀點[30-32]。利用代謝組學研究藥用植物次生代謝產物的合成累積機制及其影響因素，對于指導藥材栽培、提高藥效成分含量具有重要意義。

2.3 逆境脅迫下植物代謝組研究

凡是對植物生長發育不利的環境條件統稱為逆境或脅迫。植物在長期進化過程中，在生長習性、生理、代謝等方面逐漸形成了各種應對逆境脅迫的適應對策。植物對逆境脅迫的耐受性和敏感性是一個復雜的生物過程，其中最重要的是代謝的改變，即植物通過調節代謝網絡以誘導產生一系列特殊代謝物，從而達到對生物、非生物脅迫的防御作用。對植物尤其是農作物的抗逆生理及分子機制已經有大量研究，但對植物如何響應各種逆境脅迫依然缺乏深入系統的了解。代謝組學可以通過監測植物體系受到脅迫或刺激后代謝產物的變化來揭示脅迫環境下植物的應答機制，是植物抗逆研究很好的途徑。因此，代謝組學已成為研究植物逆境脅迫下代謝途徑變化和耐受機理的重要手段[33]。代謝組學與其它組學技術（基因組學、轉錄組學、蛋白質組學）的整合，更有助于人們從整體上把握植物脅迫應答機制。

干旱是限制植物生長發育的重要環境因子，也是目前制約農業生產的全球性問題。Urano等[34]采用GC/TOF-MS和CE-MS方法對野生型擬南芥和NCED3基因（ABA合成相關基因）敲除突變體（nc3-2）在干旱脅迫下的代謝變化進行了分析，發現干旱脅迫下nc3-2突變體中有46種代謝物上調，野生型中有61種上調。與野生型相比，突變體中一些受ABA調控的代謝物增幅較小，如纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、葡萄糖、果糖及乙醇胺等；另一方面，一些不受ABA調控的代謝物增幅較大，如棉子糖、檸檬酸鹽、丙氨酸等。這些結果為探究干旱脅迫下植物代謝分子機制提供了新數據。

Fumagalli等[35]利用1H-高分辨率魔角旋轉（1H-high-resolution magic angle spinning， HR MAS）和NMR對兩個水稻栽培品種（Arborio和Nipponbare）在干旱和高鹽脅迫下的代謝組學進行研究，地上部和根部試驗結果表明，Arborio幼苗對兩種非生物脅迫較Nipponbare更敏感。PCA分析顯示氨基酸和糖類在脅迫條件下顯著積累，其中，Arborio幼苗的積累量較Nipponbare高，兩栽培品種間存在明顯差異。

Nam等[36，37]以野生型水稻Hwayoung和過表達AtCYP78A7基因（編碼細胞色素P450蛋白）的耐旱轉基因水稻為材料，利用1H-NMR和GC平臺分別對其地上部和籽粒在不同水分環境下的代謝組進行分析。在不同生長階段（分蘗期、抽穗期和成熟期）不同基因型水稻均能被很好地區分，土壤水分條件在一定程度上影響水稻代謝組。在抽穗期，兩基因型間由于糖類含量不同形成的明顯區分只在水分缺失條件下出現，說明水稻基因型對代謝組的影響受生長階段和水分條件的限制。籽粒代謝組結果顯示，正常澆水和干旱條件下不同基因型的水稻均能得到很好區分，基因型的不同導致了氨基酸和糖類水平的差異。與野生型水稻相比，在轉基因水稻中，干旱條件顯著提高了籽粒γ-氨基丁酸、果糖、葡萄糖、甘油、甘氨酸和乙醇含量。這些代謝物的變化可能通過一些脅迫響應通路起作用來提高轉基因水稻的耐旱能力。

土壤中可溶性鹽分過多對植物造成危害稱為鹽害或鹽脅迫。我國土壤鹽漬化現象嚴重，鹽漬土面積大、分布廣、類型多，對植物尤其是農作物耐鹽機理的研究具有重要意義。Johnson等[38]以兩種對鹽脅迫敏感程度不同的番茄株系Edkawy和Simge F1為材料，利用傅立葉變換-紅外光譜和化學計量學方法對果實的代謝指紋圖譜進行分析。有監督的DFA分析方法能夠區分兩種基因型對照和高鹽處理組的果實；采用遺傳算法（genetic algorithms， GA）鑒別應答鹽脅迫潛在的重要功能物質，包括飽和及不飽和腈化物、含氰化合物、氨基自由基和含氮化合物等。Gong等[39]利用GC-MS和生物芯片技術研究了耐鹽植物鹽芥（Thellungiella halophila）和擬南芥在鹽脅迫下代謝物的差別。與擬南芥相比，鹽芥在無鹽和高鹽環境中均具有較高的代謝水平；在150 mmol/L NaCl處理下，鹽芥的代謝響應更為復雜，糖類、糖醇、有機酸和無機離子等的代謝水平均較擬南芥高。

Widodo等[40]對耐鹽性不同的兩種大麥（Hordeum vulgare）Sahara和Clipper在鹽脅迫下的代謝反應分析顯示，鹽敏感型大麥Clipper中包括脯氨酸和γ-氨基丁酸等氨基酸以及聚胺腐胺的含量升高，這些代謝產物的積累與植株的緩慢生長和葉片壞死率有關；而在耐鹽型大麥Sahara中，己糖磷酸、三羧酸循環中間體及參與細胞保護的代謝物含量均升高，推測其與Sahara葉片的細胞保護和對高Na+的耐受有關。Shelden等[41]同樣對Sahara和Clipper應對鹽脅迫的代謝差異進行了研究，不同處在于其是以大麥根尖的根冠/細胞分裂區、伸長區和成熟區三個結構區為研究對象，鑒定了76個已知的差異代謝物，從組織和細胞水平增強了對植物耐鹽機制的理解。Wu等[42]比較了野生型大麥和栽培大麥在鹽脅迫下的代謝差異，結果顯示，滲透調節是大麥應對鹽脅迫的基本機制，野生型大麥耐鹽性較強、生長較快，在鹽脅迫下，其葉綠素和相容性溶質含量相對較高，而栽培種主要通過增加糖酵解和能量消耗來應對高鹽脅迫。

Richter等[43]利用GC-MS技術對耐鹽性不同的兩個玉米雜交種在鹽脅迫下的代謝組進行分析，結果顯示，耐鹽品種中葡萄糖、果糖和蔗糖的積累增強了其對鹽脅迫的適應能力。Yang等[44]對普通野生大豆和耐鹽野生大豆在鹽堿脅迫下的代謝組進行比較研究，發現耐鹽品種中絕大部分有機酸和脯氨酸的含量增加，TCA循環在普通大豆中增強，在耐鹽大豆中反而減弱，說明普通大豆的耐鹽機制是通過增強TCA循環產生更多ATP來應對逆境條件，而耐鹽品種可能通過調節氨基酸及有機酸合成來產生更多相容性溶質。

除了干旱和鹽堿脅迫，極端溫度、金屬離子污染等也會對植物生長產生不利影響。Jin等[45]對耐寒性不同的兩個煙草品種K326和CB-1在冷脅迫下的代謝組進行分析，GC-MS和LC-MS檢測到200個差異代謝物，其中，氨基酸和糖類如葡萄糖、果糖、肌醇等在耐寒品種K326中有較高的積累量，此外，一些次級代謝產物在兩品種中的積累量也不同。

代謝組學在植物遭受生物脅迫的研究中也得到廣泛應用。Scandiani等[46]以抗病能力不同的兩種大豆NA 4613 （敏感型）和DM 4670 （部分抗感染型）為材料，對南美大豆猝死綜合癥病菌（Fusarium tucumaniae）感染早期的根系代謝組進行研究，結果顯示，接種后7天，一些氨基酸和多胺類物質在感病品種中有較高積累量，利用這些特征能夠將兩品種進行區分。

2.4 植物代謝組的遺傳基礎研究

代謝組學已經被廣泛應用于植物代謝組的遺傳基礎研究及代謝相關功能基因鑒定中。植物組織中的代謝物水平作為代謝性狀（m-traits），往往也是受多基因控制的數量性狀，因此，可以運用數量性狀座位（quantitative trait loci， QTL）作圖對各種代謝物含量進行遺傳分析[47]。大多數代謝性狀的遺傳學基礎研究材料都是通過雜交或回交獲得的連鎖群體。

為了研究植物代謝與生物量積累的關系，Meyer等[48]以擬南芥重組自交系（RIL）群體為材料，對其初生代謝物進行QTL分析，共檢測到84個代謝物的157個QTLs和6個生物量相關QTLs。Matsuda等[49]為了揭示水稻籽粒代謝表型的遺傳背景，對水稻回交群體進行了大規模的代謝物QTL（mQTL）分析，共鑒定出759個代謝物的802個mQTLs。其中，大部分代謝物積累水平的廣義遺傳力較低，對環境因子較為敏感，如糖類和氨基酸，而一些次級代謝物如黃酮類化合物的廣義遺傳力較高。進一步通過連鎖分析對黃酮合成途徑中的糖基轉移酶基因進行了分析。Li等[50]以粳稻（Lemont）和秈稻（特青）的重組自交系群體為材料，利用代謝組學結合生長測定來定位QTL從而對其初級代謝物的遺傳變異進行研究，結果顯示，水稻初級代謝物的廣義遺傳力較低，絕大多數mQTLs只有小到中度的效應，兩個代謝相關的QTL熱點對富含碳氮的代謝物有著相反的作用，表明他們可能影響碳氮代謝平衡。

Gong等[51]以一個有高密度SNP圖譜的水稻重組自交系群體[52]為研究對象，對其劍葉和發芽種子進行代謝組分析及mQTL作圖，共鑒定出900個代謝物的超過2 800個mQTLs。對mQTLs的全基因組分布研究顯示，代謝物的遺傳調控存在明顯的熱點區域，利用數據挖掘技術從部分精度較高、遺傳效應較大的位點中鑒定獲得24個控制代謝物水平的候選基因。通過mQTL遺傳互作的分析，對水稻黃酮類物質的代謝途徑進行了重構。為了研究大麥中影響啤酒膠體穩定性的遺傳機制，Ye等[53]利用大麥Franklin/Yerong雙單倍體（DH）群體對酒精冷渾濁（ACH）QTL進行分析，發現了一個相關QTL，qACH。由蛋白質組分析鑒定出的兩個關鍵渾濁活性蛋白基因（BATI-CMb和BATI-CMd）與qACH位于染色體的同一位置，推測BATI-CMb和BATI-CMd是qACH的候選基因，控制著啤酒膠體的穩定性。對Franklin和Yerong中BATI-CMb和BATI-CMd核酸和氨基酸序列的多態性分析可以開發相應的基因分子標記，用于大麥的分子輔助選擇育種。多平臺的代謝組學分析與mQTL的聯合研究對于代謝相關功能基因的鑒定和代謝網絡模型的構建有著重要意義。

mQTL定位在植物遺傳代謝組學研究中取得許多進展，但該方法局限于連鎖群體的使用，存在重組位點少、群體構建費時費力、無法覆蓋多個不同品種等問題。隨著高通量基因分型檢測技術的發展，全基因組關聯分析（genome-wide association study，GWAS）結合代謝組學已成為植物數量遺傳學研究強有力的工具[54]。

Chan等[55]為了研究擬南芥中硫代糖苷代謝途徑的遺傳結構，采用GWAS對96個擬南芥品種包含40多個硫代糖苷表型性狀進行分析，結果顯示，每個發育階段與硫代糖苷關聯的位點都不相同。采用共表達網絡（co-expression network）方法從數量龐大的GWAS位點中篩選出許多影響硫代糖苷積累的候選基因。Wen等[56]從368份玉米自交系中鑒定出983個代謝物，利用GWAS定位了1 459個性狀顯著關聯位點。進一步通過自交系群體的eQTL（expression QTL）與RIL群體的mQTL對mGWAS顯著位點進行了驗證，并利用重測序和候選基因關聯分析鑒定出5個典型候選基因的潛在變異。Chen等[57]通過對529個水稻自然變異群體的廣泛靶向代謝組學分析，結合mGWAS分析，檢測出634個控制代謝物自然變異的顯著遺傳位點。通過數據挖掘注釋了36個調控生理、營養相關代謝物的候選基因，并進一步利用遺傳和生化分析手段鑒定了其中5個候選基因。Matsuda等[58]采用mGWAS方法解析水稻次級代謝物自然變異的遺傳結構，從175份水稻自然品種中鑒定出89個代謝物的323個顯著位點，數據分析顯示大部分代謝性狀只與少量的強QTLs緊密關聯。Dong等[59]采用代謝組學結合GWAS對水稻中酚胺的時空積累模式進行研究，定位了多個控制酚胺含量自然變異的位點，并通過轉基因驗證了兩個亞精胺羥基肉桂轉移酶的候選基因?；趍GWAS技術從基因到代謝水平的分析已成為功能基因鑒定和以組學為基礎的作物遺傳改良的有用工具。

QTL分析及GWAS促進了植物代謝組學與功能基因組學的研究，但兩者在應用上各有利弊，將兩者結合起來，并整合轉錄組學、蛋白質組學更有助于從整體上把握植物代謝的遺傳機制。Wu等[60]將多種單一方法（GWAS、RIL、IL、代謝組-轉錄組網絡分析）進行整合對擬南芥初級代謝的關鍵調控因子進行研究，利用mGWAS方法從314個擬南芥自然品種中定位了94個初級代謝物的617個顯著位點，然后將這些位點與先前發表的利用擬南芥RILs和 ILs群體鑒定的mQTLs數據進行比較驗證，同時，利用已報道的擬南芥轉錄組和代謝組數據構建代謝-轉錄關聯網絡，來進一步驗證鑒定的位點。經過綜合分析，共得到92個主要的位點，從中篩選出76個代謝候選基因，并進一步通過功能缺失突變體驗證了兩個分別與酪氨酸降解和β-丙氨酸代謝相關的新基因。整合數量遺傳學與網絡分析的綜合方法能夠大大提高位點鑒定的靈敏性和精確度。

組學聯合技術也同樣被應用于作物抗逆代謝組學的遺傳基礎研究中。Jin等[45]對冷脅迫下兩種耐寒性煙草品種進行代謝組學分析的同時，也對其進行了轉錄組學研究，分別從CB-1和K326中鑒定出14 590和14 605個差異表達基因（DEGs），其中有約50%為冷誘導基因，且耐寒品種K326中大部分冷誘導基因的表達變化程度高于CB-1。為了挖掘小麥赤霉病抗性QTL區間內的有效基因，Dhokane等[61]采用代謝組學和轉錄組學聯合研究了攜帶抗性和敏感性等位基因（QTL-Fhb2）的小麥重組自交系，結合側翼標記序列分析，鑒定出4-香豆酸：CoA連接酶（4CL）、胼胝質合成酶（CS）、堿性螺旋-環-螺旋（bHLH041）轉錄因子、谷胱甘肽S-轉移酶（GST）、ABC轉運蛋白-4（ABC4）和肉桂醇脫氫酶（CAD）位點為QTL-Fhb2區域內潛在的抗性基因，有助于構建植物響應赤霉病的完整分子機制。Ma等[62]對兩個不同耐旱水稻品種（不耐旱品種IRAT109和耐旱品種IAC1246）進行代謝組和轉錄組分析，來探究干旱脅迫下維持光合作用的關鍵代謝途徑。在干旱和水分充足條件下，分別從兩品種中鑒定出4 059、2 677個差異表達基因以及67、49個差異代謝物，其中6個差異代謝物以及215個DEGs與滲透勢和抗氧化能力顯著相關。在耐旱品種IAC1246中，4-羥基肉桂酸和阿魏酸與光合作用相關DEGs的上調趨勢一致，因此，4-羥基肉桂酸和阿魏酸被認為是水稻抗旱關鍵代謝物，其代謝途徑中的DEGs則有望成為耐旱候選基因。這說明以代謝物為基礎并結合轉錄組學方法是篩選抗旱基因的一種有效方法。

3 問題與展望

代謝組學是一門交叉學科，其與生物科學、分析化學、化學計量學及生物信息學等多種學科密切相關，是系統生物學研究中的一個重要環節。隨著分析檢測技術的發展，特別是基于質譜及核磁共振的代謝譜分析的發展，代謝組學的研究領域不斷擴展。但作為一門新興學科，代謝組學仍處于發展階段，仍然面臨著許多亟待解決的問題，如檢測靈敏度的提高，通用檢測方法的開發，無偏性、高通量定量分析的實現以及代謝組學數據注釋的完備等。自動化、標準化、完整化的代謝組學研究技術是未來的發展方向。

在植物代謝研究方面，代謝組學將單一、少量的代謝物分析發展成整體或某個層面的海量代謝數據的研究，突破了研究層面窄的局限性。尤其是通過對代謝組學數據與基因組學、轉錄組學等其他組學數據的整合，為植物代謝途徑及遺傳結構的研究開辟了新局面。然而，各類組學分析方法在應用上各有優缺點，如何根據研究目標、對象及試驗設計選擇合適的技術手段或從已有的海量數據中選取有用的信息，是研究者們需要不斷探討的問題。隨著分離檢測技術的不斷提高、多平臺數據的綜合應用以及生物信息學的發展，代謝組學將在闡述生物過程的分子機理中發揮不可替代的作用。

參 考 文 獻：

[1] Fiehn O， Kopka J， Dormann P， et al. Metabolite profiling for plant functional genomics[J]. Nat. Biotechnol.，2000， 18（11）：1157-1161.

[2] Fiehn O. Link between genotypes and phenotypes[J]. Plant Mol. Biol.， 2002， 48（2）： 155-171.

[3] Griffiths W J. Metabolomics， metabonomics and metabolite profiling[M]. London： The Royal Society of Chemistry， 2008.

[4] Dixon R A，Strack D. Phytochemistry meets genome analysis and beyond[J]. Phytochemistry， 2003， 62（6）：815-816.

[5] Nakabayashi R，Saito K. Metabolomics for unknown plant metabolites[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry， 2013，405（15）：5005-5011.

[6] Hardy N W，Hall R D. Plant metabolomics： methods and protocols[M]. New York： Humana Press， 2012.

[7] 邱德有，黃璐琦. 代謝組學研究——功能基因組學研究的重要組成部分[J].分子植物育種， 2004， 2（2）：165-177.

[8] Griffin J L， Cemal C K， Pook M A. Defining a metabolic phenotype in the brain of a transgenic mouse model of spinocerebellar ataxia 3 [J]. Physiol. Gen.， 2004， 16（3）：334-340.

[9] Bollard M E， Stanley E G， Lindon J C， et al. NMR-based metabonomic approaches for evaluating physiological influences on biofluid composition [J]. NMR Biomed.，2005，18（3）： 143-162.

[10]Lei Z， Huhman D V， Sumner L W. Mass spectrometrystrategies in metabolomics[J]. Journal of Biological Chemistry， 2011， 286（29）： 25435-25442.

[11]Dettmer K， Aronov P A， Hammock B D. Mass spectrometry based metabolomics[J]. Mass Spectrometry Reviews， 2007， 26（1）： 51-78.

[12]Ernst M， Silva D B， Silva R R， et al. Mass spectrometry inplant metabolomics strategies： from analytical platforms to data acquisition and processing[J]. Natural Product Reports， 2014， 31（6）： 784-806.

[13]Wang Y， Lu X， Xu G W. Development of a comprehensive two-dimensional hydrophilic interaction chromatography/quadrupole time-of-flight mass spectrometry system and its application in separation and identification of saponins from Quillaja saponaria[J]. Journal of Chromatography A， 2008，1181（1/2）：51-59.

[14]Vuckovic D. Current trends and challenges in sample preparation for global metabolomics using liquid chromatography-mass spectrometry[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry， 2012， 403（6）： 1523-1548.

[15]Theodoridis G A， Gika H G， Want E J， et al. Liquid chromatography-mass spectrometry based global metabolite profiling： a review[J]. Analytica Chimica Acta， 2012， 711： 7-16.

[16]Rainville P D， Theodoridis G， Plumb R S， et al. Advances in liquid chromatography coupled to mass spectrometry for metabolic phenotyping[J]. Trends in Analytical Chemistry， 2014， 61：181-191.

[17]劉賢青，羅杰. 植物代謝組學技術研究進展[J]. 科技導報，2015，33（16）：33-38.

[18]Mak T D，Laiakis E C，Goudarzi M，et al. MetaboLyzer： a novel statistical workflow for analyzing postprocessed LC-MS metabolomics data[J]. Analytical Chemistry， 2014， 86 （1）：506-513.

[19]Mumm R， Hageman J A， Calingacion M N， et al. Multi-platform metabolomics analyses of a broad collection of fragrant and non-fragrant rice varieties reveals the high complexity of grain quality characteristics[J]. Metabolomics，2016，12（2）：38.

[20]Kusano M， Fukushima A， Fujita N，et al. Deciphering starch quality of rice kernels using metabolite profiling and pedigree network analysis[J]. Molecular Plant， 2015， 5（2）：4425-4451.

[21]Chen Y Z， Pang Q Y， He Y， et al. Proteomics and metabolomics of Arabidopsis responses to perturbation of glucosinolate biosynthesis[J]. Molecular Plant， 2012， 5（5）：1138-1150.

[22]Aharoni A， Ric de Vos C H， Verhoeven H A， et al. Nontargeted metabolome analysis by use of fourier transform ion cyclotron mass spectrometry[J]. Omics， 2002， 6（3）： 217-234.

[23]Park H E， Lee S Y， Hyun S H， et al. Gas chromatography/mass spectrometry-based metabolic profiling and differentiation of ginseng roots according to cultivation age using variable selection[J]. Journal of AOAC International， 2013， 96（6）： 1266-1272.

[24]賈巖，張福生，肖淑賢，等. 款冬花不同發育階段的代謝組學和比較轉錄組學分析[J]. 中國生物化學與分子生物學報， 2017， 33（6）：615-623.

[25]Ahmad R， Baharum S N， Bunawan H， et al. Volatile profiling of aromatic traditional medicinal plant， Polygonum minus in different tissues and its biological activities[J]. Molecules， 2014， 19（11）：19220-19242.

[26]Qin X M，Dai Y T，Liu N Q，et al. Metabolic fingerprinting by 1H-NMR for discrimination of the two species used as Radix Bupleuri[J]. Planta Medica，2012，78（9）：926-933.

[27]劉悅，劉川，譚爾，等. 基于DNA條形碼和1H-NMR代謝組學二維方法的多基原藏藥沙棘鑒定[J]. 中國中藥雜志， 2016， 41（4）： 578-585.

[28]韓正洲，楊勇，賈紅梅，等. 基于植物代謝組學的栽培型與野生型野菊花的化學成分比較及定量分析[J]. 藥物分析雜志， 2017， 37（7）：1196-1206.

[29]鄭文，王詩盛，鐘藝，等. 基于代謝組學技術的蟲草鑒別研究[J]. 中國現代應用藥學， 2017， 34（8）：1145-1149.

[30]Yan X F， Wu S X. Soil nutrient factors related to salidroside production of Rhodiola sachlinensis distributed in Chang Bai Mountain [J]. Environmental and Experimental Botany， 2004， 52（3）： 267-276.

[31]謝彩香， 索風梅， 賈光林， 等.人參皂苷與生態因子的相關性[J]. 生態學報， 2011， 31（24）： 7551-7563.

[32]何忠俊，黃希，梁社往，等. 滇重樓根莖皂苷含量與生態因子的關系[J]. 生態環境學報， 2016， 25（3）：409-414.

[33]邵常榮，張旸，解莉楠，等. 植物對非生物逆境響應的轉錄調控和代謝譜分析的研究進展[J]. 植物生理學報，2011， 47（5）：443-451.

[34]Urano K， Maruyama K， Ogata Y， et al. Characterization of the ABA-regulated global responses to dehydration in Arabidopsis by metabolomics[J]. Plant Journal， 2009， 57：1065-1078.

[35]Fumagalli E， Baldoni E， Abbruscato P， et al. NMR techniques coupled with multivariate statistical analysis： tools to analyse Oryza sativa metabolic content under stress conditions[J]. Journal of Agronomy and Crop Science， 2009， 195：77-88.

[36]Nam K H， Shin H J， Pack I S，et al. Growth stage-based metabolite profiling of drought-tolerant transgenic rice under well-watered and deficit conditions[J]. Plant Omics Journal， 2015， 8（6）：587-594.

[37]Nam K H， Shin H J， Pack I S，et al. Metabolomic changes in grains of well-watered and drought-stressed transgenic rice[J]. J. Sci. Food Agric.， 2016， 96（3）：807-814.

[38]Johnson H E， Broadhurst D， Goodacre R， et al. Metabolic fingerprinting of salt-stressed tomatoes[J]. Phytochemistry， 2003， 62（6）：919-928.

[39]Gong Q，Li P，Ma S，et al. Salinity stress adaptation competence in the extremophile Thellungiella halophila in comparison with its relative Arabidopsis thaliana[J]. The Plant Journal，2005，44（5）：826-839.

[40]Widodo J H P， Patterson J H， Newbigin E， et al . Metabolic responses to salt stress of barley （Hordeum vulgare L.） cultivars， Sahara and Clipper， which differ in salinity tolerance[J]. Journal of Experimental Botany，2009， 60： 4089-4103.

[41]Shelden M C， Dias D A， Jayasinghe N S， et al. Root spatial metabolite profiling of two geno types of barley （Hordeum vulgare L.） reveals differences in response to short-term salt stress[J]. J. Exp. Bot.， 2016， 67 （12）： 3731-3745.

[42]Wu D Z， Cai S G， Chen M X， et al. Tissue metabolic responses to salt stress in wild and cultivated barley[J]. PLoS One， 2013， 8（1）： e55431.

[43]Richter J A， Erban A， Kopka J， et al. Metabolic contribution to salt stress in two maize hybrids with contrasting resistance[J]. Plant Science， 2015， 233： 107-115.

[44]Yang D S， Zhang J， Li M X，et al. Metabolomics analysis reveals the salt-tolerant mechanism in Glycine soja[J]. Journal of Plant Growth Regulation， 2017， 36（2）：460-471.

[45]Jin J J， Zhang H， Zhang J F， et al. Integrated transcriptomics and metabolomics analysis to characterize cold stress responses in Nicotiana tabacum[J]. BMC Genomics， 2017， 18（1）：496.

[46]Scandiani M M， Luque A G， Razori M V， et al. Metabolic profiles of soybean roots during early stages of Fusarium tucumaniae infection[J]. Journal of Experimental Botany ， 2015， 66 （1）：391-402.

[47]Suhre K， Gieger C. Genetic variation in metabolic phenotypes： study designs and applications[J]. Nat. Rev. Genet.， 2012， 13（11）： 759-769.

[48]Meyer R C， Steinfath M， Lisec J， et al. The metabolic signature related to high plant growth rate in Arabidopsis thaliana[J]. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 2007， 104（11）： 4759-4764.

[49]Matsuda F， Okazaki Y， Oikawa A， et al. Dissection of genotype-phenotype associations in rice grains using metabolome quantitative trait loci analysis[J]. Plant J.， 2012， 70（4）： 624-636.

[50]Li B H， Zhang Y Y， Mohammadi S A， et al. An integrative genetic study of rice metabolism， growth and stochastic variation reveals potential C/N partitioning loci[J]. Sci. Rep.， 2016， 6： 30143.

[51]Gong L， Chen W， Gao Y， et al. Genetic analysis of the metabolome exemplified using a rice population[J]. PNAS， 2013， 110（50）： 20320-20325.

[52]Yu H， Xie W， Wang J， et al. Gains in QTL detection using an ultra-high density SNP map based on population sequencing relative to traditional RFLP/SSR markers[J]. PLoS One， 2011， 6（3）： e17595.

[53]Ye L Z， Huang Y Q， Dai F， et al. Identification of two key genes controlling chill haze stability of beer in barley （Hordeum vulgare L.） [J]. BMC Genomics， 2015， 16 （1）：449.

[54]Riedelsheimer C， Lisec J， Czedik-Eysenberg A， et al. Genome-wide association mapping of leaf metabolic profiles for dissecting complex traits in maize[J]. PNAS， 2012， 109（23）： 8872-8877.

[55]Chan E K， Rowe H C， Corwin J A， et al. Combining genome-wide association mapping and transcriptional networks to identify novel genes controlling glucosinolates in Arabidopsis thaliana[J]. PLoS Biol.， 2011， 9（8）：e1001125.

[56]Wen W， Li D， Li X， et al. Metabolome-based genomewide association study of maize kernel leads to novel biochemical insights[J]. Nat. Commun.， 2014， 5： 3438.

[57]Chen W， Gao Y， Xie W， et al. Genome-wide association analyses provide genetic and biochemical insights into natural variation in rice metabolism[J]. Nat. Genet.， 2014， 46（7）： 714-721.

[58]Matsuda F， Nakabayashi R， Yang Z， et al. Metabolome genome-wide association study dissects genetic architecture for generating natural variation in rice secondary metabolism[J]. Plant J.， 2015， 81（1）： 13-23.

[59]Dong X， Gao Y， Chen W， et al. Spatio-temporal distribution of phenolamides and the genetics of natural variation of hydroxycinnamoyl spermidine in rice[J]. Mol. Plant， 2015， 8（1）： 111-121.

[60]Wu S， Alseekh S， Cuadros-Inostroza ，et al. Combined use of genome-wide association data and correlation networks unravels key regulators of primary metabolism in Arabidopsis thaliana[J]. PLoS Genet.， 2016， 12（10）： e1006363.

[61]Dhokane D， Karre S， Kushalappa A C， et al. Integrated metabolo-transcriptomics reveals Fusarium head blight candidate resistance genes in wheat QTL-Fhb2[J]. PLoS One，2016， 11（5）： e0155851.

[62]Ma X S， Xia H， Liu Y H， et al. Transcriptomic and metabolomic studies disclose key metabolism pathways contributing to well-maintained photosynthesis under the drought and the consequent drought-tolerance in rice[J]. Front Plant Sci.， 2016， 7：1886.