蘋果病原真菌拮抗菌HMQAU140045的分離與鑒定

趙云福+邱東曉+梁晨+王佳寧

摘要：為開發(fā)蘋果病原真菌生防菌劑，采用稀釋分離法、生長速率法、平板對峙法等從土壤中篩選出對蘋果腐爛病（Cytospora mandshurica）、輪紋病（Botryosphaeria dothidea）、斑點落葉病（Alternaria mali）具有明顯拮抗作用的菌株，并根據(jù)其形態(tài)、生理生化特征、16S rDNA序列分析等進行鑒定。結果表明，菌株HMQAU140045抑菌效果顯著，對3種蘋果病原真菌菌絲生長和孢子萌發(fā)均有顯著抑制作用，經其無菌發(fā)酵濾液處理后，病原菌菌絲畸形，分支增多，局部膨大，分生孢子不萌發(fā)或萌發(fā)產生的芽管畸形腫大成球狀泡。鑒定結果表明該菌株為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

關鍵詞：蘋果真菌病害；拮抗菌株；分離；鑒定；解淀粉芽孢桿菌

中圖分類號：S476.19文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2017）12-0054-05

Abstract An antagonistic bacterium strain HMQAU140045 with strong inhibitory activity against three fungal pathogens from apple trees （e.g. Cytospora mandshurica， Botryosphaeria dothidea， and Alternaria mali） was isolated from soil by using dilution plate method， plate growth rate and flat confrontation culture method.The strain was identified as Bacillus amyloliquefaciens based on the 16S rDNA sequence homology， the physiological and biochemical characteristics and morphological observation. The strain had significant inhibitory effect on mycelial growth and spore germination of the three apple pathogenic fungi. After treated by HMQAU140045 fermentation filtrate， the mycelia were malformed， spores did not germinate or generated germ tubes swollen to form spherical bubbles.

Keywords Apple fungal diseases； Antagonistic bacteria strain； Isolation； Identification； Bacillus amyloliquefaciens

中國是世界上最大的蘋果生產國和消費國，栽培面積和產量均居世界首位[1]。近年來，隨著果樹種植結構調整，病害發(fā)生程度日趨嚴重。目前已知蘋果病害90余種，其中腐爛病、輪紋病、斑點落葉病、炭疽病等真菌性病害為各蘋果產區(qū)最常見和嚴重病害[2，3]。

目前蘋果真菌性病害的防治主要依賴化學農藥，化學農藥的頻繁施用不僅易造成環(huán)境污染，病原菌抗性增加，而且成為威脅蘋果質量安全的最主要風險因素，因此尋找安全可行的病害控制手段成為當前果業(yè)生產中亟待解決的問題。生物防治以其綠色、無污染、不易產生抗性等優(yōu)點受到人們普遍關注，利用生防細菌來防治植物病害是生物防治的一種主要手段。張淑穎等[4]從劍麻葉片分離獲得一株枯草芽孢桿菌，對離體枝條上蘋果腐爛病菌的擴展有較好的抑制效果。馬榮等[5]通過組織分離、平板對峙法篩選得到對蘋果腐爛病菌拮抗效果達到87%的枯草芽孢桿菌。黃玲玲等[6]利用解淀粉芽孢桿菌NCPSJ7發(fā)酵液、菌懸液及其無菌胞外抗菌蛋白對蘋果輪紋病菌平板抑制和果體抑制效果分別進行了試驗，指出其發(fā)酵液、菌懸液的抑菌作用更好。目前針對蘋果拮抗微生物的研究已做了很多工作，但尚未見利用拮抗菌防治蘋果園常見真菌性病害的報道。本文以蘋果腐爛病、輪紋病、斑點落葉病等為靶標病害，通過廣泛采樣，篩選出拮抗譜較廣的菌株，以期為生防菌劑開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

煙臺、青島、淄博等地蘋果園、桃園、藍莓園根際土壤。

1.2 供試菌株及培養(yǎng)基

蘋果腐爛病菌（Cytospora mandshurica）、蘋果輪紋病菌（Botryosphaeria dothidea）、斑點落葉病菌（Alternaria mali）、炭疽病菌（Glomerella cingulata）等采自煙臺棲霞、蓬萊蘋果園，青島農業(yè)大學真菌學研究室分離保存。

1.3 培養(yǎng)基

LB、PD、PDA培養(yǎng)基等[7]。

1.4 拮抗菌株的分離、篩選

采用稀釋分離法對不同來源的土壤樣品進行菌株分離，選取不同菌落進行劃線純化，編號、保存?zhèn)溆谩２捎脤χ排囵B(yǎng)法[8]從細菌菌株中篩選對蘋果腐爛病菌、輪紋病菌、斑點落葉病菌、炭疽病菌有拮抗作用的菌株，測量抑菌帶寬度。試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 進行統(tǒng)計處理和鄧肯氏新復極差檢驗。

1.5 拮抗菌株發(fā)酵濾液對蘋果病原真菌的抑制作用試驗

采用菌絲生長速率法測定拮抗菌株發(fā)酵液稀釋50、100、150、200倍對蘋果病原菌的抑制作用。種子液及發(fā)酵條件：將拮抗菌用接種環(huán)刮取接種到LB液體培養(yǎng)基中，30℃搖床振蕩培養(yǎng)24 h得到種子液。培養(yǎng)好的種子液按1.5%的比例接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，配方為玉米粉2.0%、胰蛋白胨1.0%、酵母提取物1.0%、磷酸氫二鉀0.5%、pH值6.5，培養(yǎng)溫度28℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)80 h，經0.22 μm細菌過濾器過濾除菌。將發(fā)酵濾液滴于溶化的PDA培養(yǎng)基中，使其稀釋不同倍數(shù)，凝固后，接種6 mm病原菌菌餅，4 d后顯微鏡下觀察病原菌菌絲生長形態(tài)，并拍照，采用十字交叉法測量對照組直徑和處理組直徑，計算抑菌率[9]。用無菌水制備成濃度為 106個/mL 的孢子懸浮液備用。將拮抗菌發(fā)酵濾液按 50、100、150、200倍的稀釋比例分別與不同病原菌孢子懸浮液混勻，各取25 μL 滴在載玻片中央，并置于裝有1%水瓊脂的培養(yǎng)皿中密封，25℃恒溫保濕36 h 后觀察孢子萌發(fā)情況，計算對孢子萌發(fā)抑制率，并拍照[10，11]。endprint

1.6 拮抗菌株的鑒定

拮抗菌株形態(tài)觀察和生理生化特性分析參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[12]。

用改良CTAB法提取拮抗菌株基因組DNA[13]。

拮抗菌株16S rDNA 的 PCR 擴增及序列分析：提取菌株基因組 DNA 后，利用細菌通用引物27-F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3′）和 1492-R（5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′）對拮抗菌株基因組 DNA 進行 PCR 擴增。PCR 反應體系（25 μL）：2×PCR Master Mix 5 μL，27F/1492R（10 μmol/L）各 1 μL，模板 DNA 5 μL，補水至 25 μL。反應條件：94℃預變性 5 min；94℃變性 1 min，53℃復性 1 min，72℃延伸 1 min，30 個循環(huán)；72℃延伸 7 min。擴增產物經 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，由上海生工生物工程有限公司進行純化及雙向測序，測序結果與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知16S rDNA序列進行BLAST比對，利用MEGA 6.0構建系統(tǒng)發(fā)育樹[14]。

2 結果與分析

2.1 拮抗菌株的分離與篩選

從不同土壤樣品中共分離得到細菌48株。通過對峙培養(yǎng)法從中篩選出對幾種蘋果病原真菌均具有明顯拮抗作用的拮抗細菌3株，見表1。3株拮抗菌均對蘋果腐爛病菌拮抗效果最好，抑菌帶寬度均達9.4 mm及以上，且均對炭疽病菌拮抗效果稍差。綜合比較，選取對各病原菌抑制效果相對較好的菌株HMQAU140045進行后續(xù)研究。

2.2 拮抗菌株發(fā)酵濾液對蘋果病原真菌抑制作用

由表2可知，菌株HMQAU140045發(fā)酵濾液對蘋果腐爛病菌的抑菌效果最好，稀釋50～100倍對菌絲生長的抑制率均可達100%，隨稀釋倍數(shù)的增大對菌絲的抑制率逐漸下降，稀釋200倍后抑制率仍達82.06%；對孢子萌發(fā)抑制率與對菌絲的表現(xiàn)相似，發(fā)酵液稀釋200倍孢子萌發(fā)抑制率仍達92.74%。菌株發(fā)酵液對輪紋病菌和斑點落葉病菌的抑制作用表現(xiàn)類似腐爛病菌。菌株HMQAU140045各稀釋倍數(shù)發(fā)酵液對3種病原菌的平板抑菌效果見圖1。

圖2鏡檢發(fā)現(xiàn)，未經處理的分生孢子萌發(fā)后芽管粗壯均勻，生長迅速；經發(fā)酵濾液處理的病原菌分生孢子及芽管明顯畸形，孢子萌發(fā)芽管很短或分生孢子顯著膨大畸形，芽管不能繼續(xù)伸長。對照病原菌菌絲粗細均勻、分枝較少，經發(fā)酵液處理病原菌菌絲顏色明顯加深，菌絲中間或頂端顯著膨大，有的菌絲分支增多，甚至多條菌絲聚集融合在一起，部分菌絲細胞質外滲。

結果表明菌株HMQAU140045產生拮抗活性物質對蘋果病原真菌菌絲生長和孢子萌發(fā)具有顯著的抑制作用。

2.3 拮抗菌形態(tài)和生理生化鑒定

菌株HMQAU140045于LB固體培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)2 d，菌落直徑0.5～2.5 mm，菌落凸起呈乳白色、不透明、圓形、邊緣不規(guī)則、表面有褶皺，在菌落邊緣有晶體狀物質。菌體革蘭氏染色陽性，桿狀（0.93±0.24）～ （2.01±0.52） μm，單個或成對排列，產芽孢。該菌株既不好氧，也不厭氧，其糖醇類發(fā)酵、接觸酶試驗、檸檬酸鹽利用、硝酸鹽還原、V-P測定等為陽性反應，甲基紅和反硝化反應為陰性，抗逆性表現(xiàn)較強，其它生理生化鑒定結果見表3。

2.4 菌株分子生物學鑒定

利用細菌通用引物27F/1492R對菌株HMQAU140045的16S rDNA片段進行PCR擴增，經測序分析，確定該片段全長1 492 bp。將擴增得到的序列與GenBank中BLAST數(shù)據(jù)庫中的核酸序列進行同源性比較，構建系統(tǒng)進化樹如圖3。結果表明，菌株HMQAU140045與解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens（GenBank登錄號為KP686229）的同源性達到99%，菌株HMQAU140045與4株Bacillus amyloliquefaciens菌株的序列位于系統(tǒng)發(fā)育樹的同一分支。

綜合形態(tài)學觀察、生理生化特性和16S rDNA序列分析同源性比對數(shù)據(jù)和系統(tǒng)發(fā)育樹位置，將菌株HMQAU140045鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

3 討論與結論

蘋果生產中對常見真菌性病害以化學防治為主，施藥頻次高，對環(huán)境壓力大，以斑點落葉病為例，周年防治次數(shù)7次以上，目前可用登記農藥品種500個左右（截至2016年12月），而登記的活體微生物殺菌劑產品仍為空白。本研究篩選出的HMQAU140045對供試3種蘋果病原真菌均有較強的抑菌活性，經菌落形態(tài)觀察、生理生化鑒定以及16S rDNA 序列分析，最終確定菌株HMQAU140045為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），是一種與枯草芽孢桿菌具有很高親緣性且具有廣泛抑菌譜的細菌。陳士云等[15]從土壤中分離出解淀粉芽孢桿菌CH-2，發(fā)現(xiàn)其培養(yǎng)液經硫酸銨沉淀后能抑制油菜核盤菌菌絲的生長，還可抑制菌核的形成；陳成等[16]分離得到一株解淀粉芽孢桿菌，對黑曲霉、稻瘟病菌、水稻紋枯病菌等均有良好的抑制作用；陳蕾蕾等[17]發(fā)現(xiàn)一株廣譜抗菌解淀粉芽孢桿菌，菌體及發(fā)酵液具有拮抗桃根霉腐爛病、黃瓜枯萎病、棗炭疽病、梨黑斑病、蘋果褐腐病等植物病原菌及拮抗金黃色葡萄球菌、甲型副傷寒沙門氏菌、酵母等食源性致病菌和腐敗菌的作用，廣譜抗菌并且效果穩(wěn)定持久。

解淀粉芽孢桿菌在其生長過程中能夠產生多種抑菌物質，具有廣泛抑制真菌與細菌的功能，主要抑制分生孢子的萌發(fā)和菌絲生長，以及導致病原菌菌絲畸形，如頂端膨大、分支增多、細胞質外滲等[18-20]，這在本研究中也得到部分證實。近幾年關于解淀粉芽孢桿菌抑菌機制的研究報道越來越多，有的研究已經深入到分子水平[21]。本研究篩選的解淀粉芽孢桿菌對蘋果樹幾種真菌性病害拮抗活性較高，具有較好的開發(fā)和應用價值。endprint

參 考 文 獻：

[1] 陳學森， 郝玉金， 楊洪強， 等. 我國蘋果產業(yè)優(yōu)質高效發(fā)展的10項關鍵技術[J]. 中國果樹， 2010（4）：65-67.

[2] 王京禮. 植物病害防治原理在蘋果病害防治上的應用[J]. 現(xiàn)代園藝， 2015 （12）： 50.

[3] 胡清玉， 胡同樂， 王亞南， 等. 中國蘋果病害發(fā)生與分布現(xiàn)狀調查[J]. 植物保護， 2016， 42（1）： 175-179.

[4] 張淑穎， 曲田麗， 孫陽， 等. 劍麻內生細菌 JM-3 對蘋果腐爛病抑制作用的研究[J]. 華北農學報， 2013， 28（4）： 208-213.

[5] 馬榮， 劉曉琳， 王曉煒， 等. 新疆蘋果樹腐爛病拮抗細菌的篩選與初步鑒定[J]. 新疆農業(yè)大學學報， 2015， 38（2）： 136-139.

[6] 黃玲玲， 裘紀瑩， 唐琳， 等. 解淀粉芽胞桿菌 NCPSJ7 對采后蘋果輪紋病的生物防治作用[J]. 中國食物與營養(yǎng)， 2015， 21（2）： 20-24.

[7] 沈萍，陳向東.微生物學實驗[M]. 第4版. 北京：高等教育出版社，2007.

[8] Zhou X H， Lu Z X， Lv F X， et al. Antagonistic action of Bacillus subtilis strain fmbj on the postharvest pathogen Rhizopus stolonifer[J]. Journal of Food Science， 2011， 76（5）：254-259.

[9] 鄧振山， 陳苗， 張偉民，等. 蘋果樹內生真菌抗腐爛病和炭疽病活性菌株的篩選[J]. 微生物學雜志， 2015（5）：61-66.

[10]王彩霞， 張清明， 李桂舫， 等. 蘋果樹腐爛病拮抗細菌菌株 BJ1 的鑒定及其抑菌作用[J]. 植物保護學報， 2012， 39（5）： 431-437.

[11]郜佐鵬， 柯希望， 韋潔玲， 等. 七株植物內生放線菌對蘋果樹腐爛病的防治作用[J]. 植物保護學報， 2009，36 （5）： 410-416.

[12]蔡妙英， 東秀珠. 常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京：科學出版社，2001.

[13]張曉娟， 宋萍， 王柱，等. 23株芽孢桿菌16S rRNA基因序列擴增與系統(tǒng)發(fā)育分析[J]. 食品與發(fā)酵科技， 2012， 48（2）：9-12.

[14]Sontakke S. Use of broad range 16S rDNA PCR in clinical microbiology[J]. Journal of Microbiological Methods， 2009， 76（3）：217-225.

[15]陳士云， 楊寶玉， 高梅影，等. 一株抑制油菜核盤菌菌核形成的解淀粉芽孢桿菌[J]. 應用與環(huán)境生物學報， 2005， 11（3）：373-376.

[16]陳成， 崔堂兵， 于平儒. 一株抗真菌的解淀粉芽孢桿菌的鑒定及其抗菌性研究[J]. 現(xiàn)代食品科技， 2011， 27（1）：36-39.

[17]陳蕾蕾， 陳相艷， 裘紀瑩，等. 廣譜抗菌解淀粉芽孢桿菌菌株及其應用： CN 103173397 B[P]. 2015.

[18]陳哲， 黃靜， 趙佳，等. 解淀粉芽孢桿菌抑菌機制的研究進展[J]. 生物技術通報， 2015， 31（6）：37-41.

[19]陳臻. 兩株生防菌株對蘋果樹腐爛病菌拮抗作用的研究[D]. 蘭州：甘肅農業(yè)大學， 2013.

[20]呂捷， 陳云， 朱從一，等. 拮抗菌Bs43的鑒定、抑菌機理及其對采后柑橘綠霉病的生防效果[J]. 果樹學報， 2014，31（5）：885-892.

[21]張寶. 解淀粉芽孢桿菌抗菌脂肽bacillomycin L的純化鑒定及抑菌機理研究[D]. 北京：中國農業(yè)大學， 2014.endprint