凝乳酶熱失活動力學研究

武彬+劉雪蘭+石天虹+閻佩佩+倫忠杰+王昭霖+井慶川

摘要：為研究凝乳酶在334～343 K熱失活動力學表現，利用Arrhenius方程，分別計算得到了不同溫度下，凝乳酶的熱失活速率常數k、半衰期t1/2，并最終計算得到了凝乳酶的失活活化能Ea為（539.58±1.55）kJ/mol。335～343 K時，數據線性回歸擬合結果較好，凝乳酶的熱失活符合一級反應動力學規律。在較低的334 K時，失活速率常數的線性回歸分析擬合度較低，凝乳酶在保溫前期失活速率常數偏高，而后期偏低，曲線斜率前后差別顯著，提示凝乳酶的熱失活可能存在中間過渡產物。

關鍵詞：凝乳酶；熱失活動力學；熱穩定性

中圖分類號：S879.1文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2017）12-0110-04

Abstract To study the thermal deactivation kinetics behavior of rennin， the Arrhenius equation was used to obtain the deactivating rate constant （k） and half-life （t1/2） at different temperatures （334～343 K）. Then， the activation energy （Ea） of deactivated rennin was obtained， which was （539.58±1.55） kJ/mol. When the temperature was in the range of 335～343 K， the deactivating rate constants could be well fitted with linear regression， which suggested that the deactivation of rennin was in accordance with the first-order kinetics model. At the lower temperature of 334 K， the curve of deactivating rate constant had lower linear fitting degree. The deactivating rate constant was on the high side at earlier stage but on the low side at later stage of heat preservation， and the curve slope was significantly different between earlier and later stages， which indicated that transition-state intermediate might be existent in the deactivation process of rennin.

Keywords Rennin； Thermal deactivation kinetics； Thermostability

凝乳酶是從小牛皺胃中發現的一種酸性天門冬氨酸蛋白酶，能水解牛奶中κ-酪蛋白的Phe105-Met106肽鍵，產物之一的副κ-酪蛋白凝結成網狀結構，并在Ca2+存在的情況下使牛奶凝結[1]。凝乳酶是制作乳酪必需的酶制劑，但必須在凝乳完成后進行加熱滅活，以盡量降低凝乳酶的蛋白酶活力，否則會使乳酪出現苦味和質構缺陷[2，3]。

小牛皺胃凝乳酶一直是乳酪生產所用的酶制劑，但其產量有限。因此，研究者分別從動物、植物、微生物中[4-6]，以及利用基因重組等方法尋找凝乳酶的低成本替代品。不同來源的凝乳酶熱穩定性有一定差別，Mohanty等[4]從水牛胃中提取到的凝乳酶熱穩定性高于小牛凝乳酶。本課題組以畢赤酵母表達的微小毛霉凝乳酶在55℃保溫20 min就會完全失活[7]。為了深入研究凝乳酶耐熱性的差異，以及為乳酪生產提供指導，有必要準確測定凝乳酶的熱穩定性。

失活動力學是研究酶熱穩定性的經典方法[8]，熱失活動力學參數（熱失活速率常數、半衰期以及失活活化能等）能夠更準確、更直觀地反映酶的熱穩定性，常用于不同狀態下酶熱穩定性的比較。如：Gouda等[9]研究了葡萄糖氧化酶的熱失活作用，以及不同無機鹽提高其熱穩定性的機理。劉晶萍等[10]采用失活動力學方法比較了果膠酶在溶液中和棉織物上的熱穩定性。李君蘭等[11]測定了鮮棗脂氧合酶的熱失活動力學參數，并與甜玉米進行了對比。張東浩等[12]在失活動力學研究的基礎上，詳細研究了海藻糖對脂肪酶的保護機理。本研究通過測定334～343 K條件下凝乳酶活力隨時間的變化情況，并根據Arrhenius方程計算得到凝乳酶的熱失活動力學參數，以便用作與其他來源凝乳酶熱穩定性的比較，同時為乳酪生產過程中凝乳酶滅活工藝的確定提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

凝乳酶購自Sigma公司；脫脂奶粉購自伊利實業有限公司；其他試劑均為分析純；水為二次去離子水。

1.2 試驗方法

1.2.1 凝乳酶活力測定 凝乳酶活力測定采用Arima法[13]：凝乳酶用0.02 mol/L、pH 6.0的磷酸緩沖液稀釋800倍，凝乳時間為40 s，將其作為初始酶液。取初始酶液0.5 mL，35℃預熱5 min后加入到5 mL 35℃預熱的pH 6.0、含1%CaCl2的10%脫脂牛乳中，計時至管壁出現顆粒，記錄凝乳時間（t）。以35℃ 40 min凝乳1 mL的酶量為1個酶活力單位（1 U）。其活力計算公式如下：

凝乳酶活力A=5×24000.5×t×n 。 （1）endprint

式中：A為凝乳酶活力，U；t為凝乳時間，s；n為稀釋倍數，本試驗為1。

1.2.2 凝乳酶熱失活測定 1.5 mL離心管中加入0.6 mL凝乳酶液，放入水浴鍋中立即開始計時，水浴完成后立即轉入冰水中快速降溫至0℃，然后取0.5 mL酶液測酶活。

2 結果與分析

2.1 凝乳酶活力測定的標準曲線

前期試驗結果表明，凝乳時間>40 s時，凝乳酶濃度與酶活力線性關系較好。將初始酶液繼續稀釋，使凝乳時間在40～600 s。以凝乳酶活力對初始酶液濃度作圖，得到凝乳酶活力標準曲線A=601.7X+9.658（R2=0.9990）（圖1）。

2.2 凝乳酶相對酶活的測定

凝乳酶在不同溫度保溫一定時間后殘余相對活力的計算公式為：

Ar=ApA0×100% 。 （2）

式中：Ar為保溫一定時間后凝乳酶殘余的相對酶活，%；Ap為保溫一定時間后凝乳酶的殘余活力，U；A0為未經保溫的凝乳酶活力，U。

凝乳酶活力隨保溫時間的延長而逐漸降低，溫度越高酶的失活速度越快。334 K保溫360 min，凝乳酶活力仍保留36.9%；而343 K保溫8 min已檢測不到酶活力（圖2）。

2.3 凝乳酶熱失活動力學參數的計算

在熱失活動力學研究中，熱失活速率常數（k）、失活半衰期（t1/2）和失活活化能（Ea）是表征酶熱穩定性的三個重要參數。不同溫度下的失活速率和半衰期反映生物酶失活快慢，熱失活活化能反映酶熱穩定性強弱。

當凝乳酶的失活遵循一級反應動力學時，則：

lnAr對保溫時間t作圖，結果如圖3所示。線性回歸的斜率即為熱失活速率常數的相反數（-k）。

凝乳酶半衰期的計算公式為：

根據（4）和（5）得到凝乳酶在不同溫度的熱失活速率常數k、線性回歸的相關系數R2以及半衰期t1/2（表1）。其中，335～343 K的線性回歸擬合結果較好，符合一級反應動力學規律。在較低的334 K擬合度不佳，其失活速率常數曲線，在90 min前后分為斜率不同的兩段，這表明凝乳酶在334 K的失活不符合一步失活反應動力學規律。因此，在計算失活活化能時，不將該點計算在內。

式中，T為反應的絕對溫度，K；Ea為失活活化能，J/mol；R為氣體常數。以lnk對1/T作圖，通過直線的斜率可計算得到失活活化能Ea為（539.58±1.55） kJ/mol。

3 討論與結論

蛋白分子中的氫鍵、二硫鍵、疏水作用、分子間作用等作用力維持著蛋白質的三維結構。酶的熱失活過程主要原因是由于分子熱運動加劇，酶分子的結構或者構象被破壞，蛋白質鏈松散化，二級、三級結構打開，導致了酶催化功能的喪失[14]。凝乳酶在334～343 K的失活速率差異極大，在334 K保溫360 min凝乳酶活力仍可保留36.9%；而在343 K保溫8 min，已檢測不到酶活力。以相對酶活的對數lnAr對保溫時間t作圖，335～343 K線性回歸擬合較好，說明在該溫度范圍內，凝乳酶的熱失活符合一級反應動力學規律，其斜率即為熱失活速率常數的相反數（-k）。在此基礎上，根據Arrhenius方程，計算得到了凝乳酶的失活活化能Ea為（539.58±1.55） kJ/mol。

然而，該方法僅適用于較高溫度下凝乳酶熱失活性質的表征。在335 K凝乳酶熱失活速率常數曲線的擬合度有所降低，而334 K線性回歸相關指數只有0.8325，該曲線分成了斜率不同的兩段。根據張東浩等[12]采用的二步失活動力學模型擬合不符合一步失活動力學模型的數據，取得了較好的結果，其模型如下：

Ek1E1k2E2

該模型能夠較好地解釋334 K凝乳酶的熱失活速率常數曲線擬合的結果，提示凝乳酶的熱失活可能存在中間過渡產物。根據二步失活動力學模型，分子熱運動能部分破壞凝乳酶分子的三級結構，使凝乳酶由初始狀態E，轉變為仍可保持一定催化功能但催化效率下降的E1。在較高溫度下，分子熱運動十分劇烈，使凝乳酶分子內外界面基團和水分子形成的氫鍵和其他次級鍵快速斷裂，E1催化活力也快速喪失，此時k2>>k1，中間產物E1對酶活力的影響較小。當溫度較低時，k2

參 考 文 獻：

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