川芎嗪對腦缺血大鼠梗死區周圍紋狀體增殖細胞分化的作用

王任翔，邱 芬（.長安大學醫院內科，陜西 西安 70064；2.西安交通大學醫學部，陜西 西安 7006；3.西安交通大學期刊中心，陜西 西安 7006）

腦整體功能的完成依賴于腦組織特定細胞表型的相互協調和結構的完整。因而，恢復腦損傷后所丟失的細胞表型并重構受損的組織結構是功能恢復的基礎。研究發現，腦缺血能刺激實驗動物成體腦內神經發生的增加。腦缺血后新生的細胞被稱為缺血誘導的多能干細胞（ischemia-induced multipotent stem cells，iSCs），它們可以分化成多種神經細胞，以補充損傷所致的神經細胞丟失，改善腦缺血后的功能[1]。從中風后人腦組織也分離出iSCs，其表達干細胞標志物nestin，在體外分化為包含神經元等多種細胞[2]，提出這些iSCs有助于中風病人的神經修復。

中藥治療腦缺血損傷具有明顯的療效，其對腦缺血的保護作用及其機制研究已陸續有報道[3-4]。動物實驗和臨床研究均證實，川芎嗪對腦缺血損傷具有保護作用，但其具體機制尚不清楚。本課題組前期研究結果顯示，川芎嗪可以促進腦缺血誘導的側腦室室下區（subventricular zone，SVZ）和海馬齒狀回顆粒下區（subgranular zone，SGZ）細胞增殖[5-6]，SVZ內的增殖細胞經不同途徑遷移至缺血紋狀體和皮質周圍，使缺血損傷區的BrdU+細胞增加[7]。而川芎嗪是否對這些遷移到損傷區的新生BrdU+細胞分化為神經元和神經膠質細胞具有促進作用，以補充因損傷所丟失的神經細胞、重構受損的組織結構，目前尚不清楚。為此，本課題組建立大鼠腦缺血模型，更進一步探討川芎嗪對大鼠腦缺血梗死區周圍紋狀體BrdU+細胞分化為神經元和神經膠質細胞的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

成年雄性SD大鼠，體質量220 ～ 260 g，由西安交通大學醫學部實驗動物中心提供。SD大鼠隨機分為假手術組、缺血模型組、川芎嗪低劑量組（20 mg.kg-1）、川芎嗪中劑量組（40 mg.kg-1）和川芎嗪高劑量組（80 mg.kg-1）5組，每組3只大鼠。所有實驗動物適應性飼養1周后進行試驗。

1.2 試劑

BrdU（美國Sigma公司），大鼠單克隆抗BrdU抗體（英國Abcam公司），小鼠單克隆抗NeuN抗體、小鼠單克隆抗GFAP抗體（美國Sigma公司），生物素標記山羊抗大鼠IgG試劑盒、生物素標記山羊抗小鼠IgG試劑盒（北京中山生物技術有限公司），DAB（武漢博士德生物工程公司），鹽酸川芎嗪注射液（無錫市第七制藥有限公司）。恒冷切片機（德國Zeiss公司）。

1.3 局灶性腦缺血模型制作和缺血損傷的判定

大鼠大腦中動脈阻塞模型采用線栓法制作。在腦缺血模型制作后2 h，參照改良的Bederson's評分方法進行神經功能缺失評分，評分≥2分視為模型成功，用于后續實驗。

1.4 給藥方法

采用BrdU標記有絲分裂細胞，BrdU免疫熒光染色陽性作為細胞增殖的標志。本研究采用連續累積式BrdU標記的方法，于術后4 h，假手術組、缺血模型組、川芎嗪低、中、高劑量組大鼠腹腔注射10 g.L-1BrdU（50 mg.kg-1，ip），qd，共21 d。川芎嗪組于術后2 h內腹腔注射20、40、80 mg.kg-1鹽酸川芎嗪注射液，qd，21 d；假手術組、模型組腹腔注射等量的生理鹽水。

1.5 BrdU/NeuN和BrdU/GFAP雙重標記免疫熒光染色

分別取缺血模型組和川芎嗪低、中、高劑量組21 d的腦片各3張，間隔200 μm，進行BrdU/NeuN和BrdU/GFAP雙重標記免疫熒光染色。具體步驟如下：① 0.01 mol.L-1PBS（pH 7.4）漂洗切片3次，1% Triton X-100室溫30 min，PBS漂洗3次，每次5 min；②50%甲酰胺（2×SSC）65 ℃孵育2 h后，2×SSC洗3次，每次5 min；③加入2 mol.L-1HCl 37 ℃孵育1 h后，0.1 mol.L-1硼酸（pH 8.5）漂洗10 min；④加封閉溶液（20 mL.L-1兔血清，3 mL.L-1Triton X-100，1 g.L-1牛血清白蛋白）室溫30 min，棄去不洗；⑤分別加入大鼠單克隆抗BrdU抗體（1 : 500）和小鼠單克隆抗NeuN抗體（1 : 300）、大鼠單克隆抗BrdU抗體（1 : 500）和小鼠單克隆抗GFAP抗體（1 : 400），37 ℃孵育1 h后，4℃孵育24 h；⑥0.01 mol.L-1PBS（pH 7.4）漂洗3次，每次5 min；⑦加入TRITC標記的山羊抗大鼠IgG（1 :100）和FITC標記的山羊抗小鼠IgG（1 : 100），室溫2 h；⑧0.01 mol.L-1PBS（pH 7.4）充分漂洗3次，每次20 min，用甘油緩沖液封片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。陰性對照切片除不加入大鼠單克隆抗BrdU抗體、小鼠單克隆抗NeuN抗體和小鼠單克隆抗GFAP抗體外，其余步驟同上。

1.6 細胞計數方法

BrdU+/NeuN+和BrdU+/GFAP+雙標細胞計數：每張腦片在高倍鏡下選取3個視野，計數BrdU+細胞及BrdU+/NeuN+和BrdU+/GFAP+雙標細胞數，計算BrdU+/NeuN+和BrdU+/GFAP+雙標細胞占BrdU+細胞的百分數，作為該腦片BrdU+細胞分化為神經元和星形膠質細胞的數值。每只大鼠選取3張腦片，間隔200 μm，取均值作為該只大鼠腦組織BrdU+細胞分化為神經元和星形膠質細胞的數值。計算每組3只大鼠BrdU+/NeuN+和BrdU+/GFAP+雙標細胞占BrdU+細胞百分數的均值，作為該組BrdU+細胞分化為神經元和星形膠質細胞的數值。

1.7 統計學處理

采用SPSS11.5統計軟件進行數據處理，計量資料用均數±標準差表示。采用方差分析，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法（LSD）。P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 梗死區周圍紋狀體增殖細胞分化為神經元及川芎嗪的作用

缺血21 d時，模型組梗死區周圍紋狀體可見BrdU+/NeuN+雙標細胞和BrdU+細胞，但BrdU+細胞分化為神經元較少。川芎嗪各劑量組梗死區周圍紋狀體亦可見BrdU+/NeuN+雙標細胞及BrdU+細胞，但隨著劑量的增大，BrdU+/NeuN+雙標細胞數增加，中、高劑量組與低劑量組比較差異均具有統計學意義（P＜ 0.05），中、高劑量組與模型組比較差異具有統計學意義（P＜ 0.01），但中、高劑量組組間比較沒有顯著性差異，見表1（*與模型組比較，#與川芎嗪低劑量組比較）。在假手術組相應區域未見BrdU+/NeuN+雙標細胞及BrdU+細胞。

表1 各組大鼠梗死區周圍紋狀體BrdU+/NeuN+雙標細胞Tab 1 BrdU+/NeuN+ cells around striatum infarction zone in rats of different groups

2.2 梗死區周圍紋狀體增殖細胞分化為星形膠質細胞及川芎嗪的作用

缺血21 d時，模型組梗死區周圍紋狀體可見BrdU+/GFAP+雙標細胞及BrdU+細胞。川芎嗪各劑量組梗死區周圍紋狀體可見BrdU+/GFAP+雙標細胞及BrdU+細胞，但各劑量組BrdU+/GFAP+雙標細胞數無顯著性差異（P＞ 0.05），與模型組比較無顯著性差異（表2）。在假手術組相應區域未見BrdU+/GFAP+雙標細胞及BrdU+細胞。

表2 各組大鼠梗死區周圍紋狀體BrdU+/GFAP+雙標細胞Tab 2 BrdU+/GFAP+ cells around striatum infarction zone in rats of different groups

3 討論

研究發現，在成體哺乳動物腦內存在神經發生，各種刺激包括腦缺血可誘導已知的神經發生區內的細胞增殖、遷移和分化，以替代腦損傷后丟失和壞死的神經細胞，有助于腦損傷的自身修復和功能恢復[8]。有研究顯示，中藥制劑華佗再造丸能促進大鼠腦缺血灌注損傷后腦神經再生和功能恢復[9]。川芎嗪在臨床上可用于腦缺血急性期和恢復期的治療[10]，療效肯定。有研究結果顯示川芎嗪對腦缺血動物模型有促進神經發生的作用，但對新生細胞的分化作用鮮有報道。本實驗在以往研究的基礎上，進一步探討川芎嗪對腦缺血后遷移至梗死周圍紋狀體的新生細胞分化為成熟神經元和星形膠質細胞的作用，觀察川芎嗪對腦缺血后神經功能恢復的可能作用機制。

本研究結果顯示，腦缺血后21 d梗死區紋狀體新生細胞向神經元表型分化，約25.09%新生細胞分化為成熟神經元，而川芎嗪作用后新生細胞分化為成熟神經元比例明顯增加，為45.23% ～ 69.51%，以川芎嗪中、高劑量組增加更為顯著。表明腦缺血后約1/4的新生細胞分化為神經元，川芎嗪能促進缺血周圍大部分新生細胞分化為神經元。提示腦缺血后梗死區周圍部分新生細胞分化為成熟神經元可能有助于補充損傷后所丟失的神經元，但數量有限，川芎嗪能明顯促進新生細胞分化為神經元，可能與其促進腦缺血后神經功能恢復有關。張蓬勃等[11]研究結果顯示，局灶性腦缺血后，SVZ內的神經干細胞/前體細胞遷移到缺血周圍并表達成熟神經元的標志，增殖的室管膜細胞在原位分化為成熟神經元，與本研究結果基本一致。

腦缺血除損傷神經元外，星形膠質細胞也受到損傷。研究發現，腦缺血后遷移到梗死區周圍的室管膜/室下區細胞分化成具有較為細長突起的星形膠質細胞，提示腦缺血后室管膜/室下區細胞的神經發生可能有助于補充損傷所致的星形膠質細胞的丟失[11]。本研究發現，腦缺血21 d時，遷移至缺血紋狀體周圍的BrdU標記細胞表達GFAP，表明部分增殖細胞分化為膠質細胞；川芎嗪作用后缺血紋狀體周圍的增殖細胞亦有部分分化為星形膠質細胞，但與缺血模型組比較沒有顯著性差異。提示腦缺血后的新生細胞部分分化為星形膠質細胞，以補充損傷丟失，而川芎嗪對新生細胞分化為星形膠質細胞沒有明顯的促進作用。

目前腦缺血后新生細胞在梗死區周圍分化的研究結果不盡相同，有研究發現，局灶性腦缺血后在胼胝體、缺血紋狀體和皮質周圍有BrdU標記細胞，5周后胼胝體的BrdU標記細胞表達轉鐵蛋白和谷胱甘肽-S轉移酶п的異構體（GST-п）（少突膠質細胞的標志），其他BrdU+細胞表達星形膠質細胞的標志，但不表達神經元的標志，提示在這些情況下新生的神經元并不能成熟或生存[12]。而本研究結果表明，腦缺血后室下區的增殖細胞經多條途徑遷移到梗死區周圍的紋狀體，并分化為成熟神經元和膠質細胞。這些結果的差異可能與缺血的嚴重程度、觀察的時間及所用大鼠種系不同有關。

研究顯示腦缺血損傷的作用機制涉及多種因素[13]，JAK/STAT通路[14]與腦缺血損傷有著緊密的聯系，影響著腦缺血后神經細胞的增殖、生長和分化等過程。本研究結果提示川芎嗪能促進梗死區紋狀體新生細胞分化為神經元，其作用機制可能與其對JAK/STAT通路的影響及抑制新生細胞凋亡、改善缺血周圍區的環境有關，深層機制仍有待進一步的研究加以驗證。

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