急性肺損傷ACE變化及地塞米松的拮抗作用

翁翠蓮，劉慶華（1.福建省立醫(yī)院呼吸內(nèi)科，福建 福州 50001；2.廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，福建 廈門 51004；.福建省立醫(yī)院耳鼻咽喉重點(diǎn)專科，福建 福州 50001）

肺內(nèi)（肺炎等）和肺外病因（膿毒癥等）都可導(dǎo)致急性肺損傷（acute lung injury，ALI），其死亡率波動(dòng)在11% ～ 68%，其中細(xì)菌感染是ALI主要原因之一。在ALI發(fā)病過程中，肺血管內(nèi)皮細(xì)胞起著關(guān)鍵作用。當(dāng)ALI時(shí)，肺血管內(nèi)皮的功能和完整性發(fā)生改變，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生更多促炎和趨化因子、血管通透性增加，促進(jìn)肺水腫形成[1-2]。但迄今為止證實(shí)唯一有效治療ALI的方法就是采用小潮氣量（6 mL.kg-1）的機(jī)械通氣治療，在藥物方面仍未找到特異、有效的藥物，有研究表明糖皮質(zhì)激素對(duì)晚期急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）（患病7 ～ 24 d）可明顯改善低氧血癥和順應(yīng)性，縮短其休克和機(jī)械通氣時(shí)間。因此探討藥物治療ALI具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)采用內(nèi)毒素（ET）制作ALI模型，地塞米松作為干預(yù)藥物，通過分析血氧飽和度及血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）活性的動(dòng)態(tài)變化，旨為臨床防治ALI提供藥物治療實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

內(nèi)毒素（ET，O55 : B5，Sigma公司）；地塞米松（Sigma公司，批號(hào)：D4092）；ACE試劑盒（海軍總醫(yī)院提供，批號(hào)：100201）。

1.2 動(dòng)物分組

24只3個(gè)月齡、雄性日本大耳白兔（購自于北京科學(xué)動(dòng)物養(yǎng)殖中心，許可證號(hào)：SCXK北京2002-2005）。將24只動(dòng)物，隨機(jī)分為3組，每組8只，分別為生理鹽水組（A組）、ET損傷組（B組）、地塞米松干預(yù)+ ET損傷組（C組）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 ALI兔模型的制作 在日本大耳白兔的耳緣靜脈注射20%烏拉坦（5 mL.kg-1）用以麻醉動(dòng)物，分別分離兔的左側(cè)頸動(dòng)靜脈，分別用于測(cè)定血氧飽和度（PaO2/FiO2），靜脈用于給藥、采血。A組經(jīng)頸靜脈5 min內(nèi)注射生理鹽水（NS）2 mL.kg-1。B組先將ET 700μg.kg-1用2 mL NS溶解，通過頸靜脈5 min內(nèi)注射完畢，隨后再次注射NS 1次，兩次NS的量為2 mL.kg-1。C組先將地塞米松5 mg.kg-1用2 mL NS溶解后注射，10 min后再注射與B組等量的ET，兩次所給的液體總量2 mL.kg-1。各組分別在試驗(yàn)0、0.5、1、2、4 h采集動(dòng)脈血進(jìn)行血?dú)夥治鰴z測(cè)，根據(jù)PaO2/FiO2計(jì)算氧合指數(shù)。1.3.2 肺組織濕重/干重比值、肺水含量測(cè)定 在試驗(yàn)4 h末使用放血療法處死日本大耳白兔，取右上肺組織稱重肺組織濕重，后將其放置在90℃的恒溫烤箱中24 h，后稱重為干重，計(jì)算出肺組織濕重/干重比值，肺水含量=（濕重–干重）/濕重×100%。

1.3.3 肺組織病理學(xué)檢查 4 h后處死日本大耳白兔，取新鮮右下肺葉組織用10%甲醛固定，石蠟包埋，HE染色，使用奧林巴斯顯微鏡行光鏡下觀察。1.3.4 血清ACE測(cè)定 ACE檢測(cè)試劑盒由海軍總醫(yī)院提供，ACE活性的檢測(cè)步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行。采用多功能紫外分光光度計(jì)比色法（波長228 nm）測(cè)定ACE活性，測(cè)定數(shù)據(jù)OD值代入試劑盒說明書所列公式計(jì)算ACE活性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示數(shù)據(jù)，PaO2/FiO2、血液ACE活性采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行重復(fù)測(cè)量方差分析，使用單因素方差分析對(duì)其余數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，組間比較使用Bonferroni方法，以P＜ 0.05為差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 各時(shí)間點(diǎn)PaO2/FiO2結(jié)果

試驗(yàn)前，3組動(dòng)物PaO2/FiO2比較無顯著性差異。A組PaO2/FiO2在整個(gè)4 h的實(shí)驗(yàn)過程中保持相對(duì)穩(wěn)定，B組動(dòng)物在0.5 h時(shí)PaO2/FiO2出現(xiàn)下降趨勢(shì)，降至最低均數(shù)為（265.4±70.2）mm Hg（＜ 300 mm Hg），隨后PaO2/FiO2呈現(xiàn)逐漸上升趨勢(shì)；C組PaO2/FiO2在0.5 h、1 h稍有下降，與A組比較無顯著性差異。詳見表1。

表1 3組PaO2/FiO2變化結(jié)果. n = 8，± s ，mm HgTab 1 Changes of PaO2/FiO2 in three groups. n = 8,± s , mm Hg

表1 3組PaO2/FiO2變化結(jié)果. n = 8，± s ，mm HgTab 1 Changes of PaO2/FiO2 in three groups. n = 8,± s , mm Hg

注：與A組比較，▲P ＜ 0.05，▲▲P ＜ 0.01；與B組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01Note: compared with group A, ▲P ＜ 0.05, ▲▲P ＜ 0.01; compared with group B, *P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01

組別 0 h 0.5 h 1 h 2 h 4 h A組 433.2±36.8425.9±29.4 467.0±38.0 454.5±32.5 439.8±23.8 B組 440.2±35.4265.4±70.2▲▲ 316.4±92.4▲▲ 394.5±115.0457.9±84.7 C組 445.8±31.6408.2±29.7** 440.1±45.7** 510.5±45.6**491.5±43.7

2.2 兔肺組織濕重/干重比值、肺水含量結(jié)果

與A組比較，B組肺組織濕重/干重比值、肺水含量明顯升高。與B組比較，C組肺組織濕重/干重比值、肺水含量顯著降低，與A組比較無顯著性差異。見表2。

表2 3組肺組織濕重/干重比值、肺水含量結(jié)果. n = 8，± sTab 2 The lung wet/dry (W/D) ratio, lung water content in three groups. n = 8,± s

表2 3組肺組織濕重/干重比值、肺水含量結(jié)果. n = 8，± sTab 2 The lung wet/dry (W/D) ratio, lung water content in three groups. n = 8,± s

注：與A組比較，▲P ＜ 0.05，▲▲P ＜ 0.01；與B組比較， *P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01Note: compared with group A, ▲P ＜ 0.05, ▲▲P ＜ 0.01; compared with group B, *P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01

組別 肺組織濕重/干重比值 肺水含量/%A組 4.706±0.101 0.787±0.005 B組 5.354±0.253▲▲ 0.813±0.009▲▲C組 4.723±0.275** 0.788±0.012**

2.3 肺組織病理學(xué)檢查結(jié)果

A組兔肺組織結(jié)構(gòu)大致正常，肺泡腔內(nèi)無明顯滲出、出血，肺組織血管壁、血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)大致正常。B組兔肺組織血管內(nèi)皮細(xì)胞明顯腫脹，血栓形成，血管壁可見較多的中性粒細(xì)胞貼壁，肺泡腔出現(xiàn)滲出，水腫液形成，透明膜形成。C組兔肺組織肺泡腔滲出、血管內(nèi)皮細(xì)胞水腫、出血、中性粒細(xì)胞貼壁現(xiàn)象低于B組。

2.4 血清ACE測(cè)定結(jié)果

靜注內(nèi)毒素前，3組動(dòng)物ACE無顯著差異。A組ACE在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中保持相對(duì)穩(wěn)定，與A組比較，B組ACE活性在給予ET 0.5 h開始明顯升高（與A組比較，68.39 ± 6.29 u.mL-1vs 47.97 ± 8.87 u.mL-1，P=0.001），血清ACE活性值在1 h達(dá)到峰值（80.13 ± 12.97 u.mL-1vs 53.59 ± 10.41 u.mL-1，與A組比較，P= 0.001），2 h后開始下降，在實(shí)驗(yàn)4 h時(shí)ACE活性仍保持在較高水平（64.66±7.45 u.mL-1vs 47.86±13.69 u.mL-1，與A組比較，P= 0.016)。與A組比較，C組血清ACE活性也出現(xiàn)升高，差異無顯著性（P＞ 0.05）。與B組比較，C組在0.5、1、2、4 h ACE活性顯著低于B組（P= 0.014，P= 0.006，P= 0.002，P= 0.017），見表3。

表3 3組血清ACE活性變化結(jié)果. u.mL-1，n = 8Tab 3 Changes of serum ACE activity in three groups. u.mL-1, n = 8

3 討論

本研究采用內(nèi)毒素方法導(dǎo)致兔ALI。B組動(dòng)物給予ET后，出現(xiàn)PaO2/FiO2降低（265.4 ＜ 300 mm Hg，PaO2/FiO2符合ALI標(biāo)準(zhǔn)），病理結(jié)果可見兔肺組織血管內(nèi)皮細(xì)胞明顯腫脹，血栓形成，血管壁可見較多的中性粒細(xì)胞貼壁，肺泡腔出現(xiàn)滲出，水腫液、透明膜形成。與A組比較，B組肺組織濕重/干重比值和肺水含量明顯高于A組，上述結(jié)果證實(shí)采用ET制作的動(dòng)物模型符合ALI改變。

ACE合成、釋放的主要部位在肺毛細(xì)血管床。ACE主要負(fù)責(zé)將血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)換為血管緊張素Ⅱ，生成的血管緊張素Ⅱ通過與血管緊張素Ⅱ的1型受體結(jié)合后促進(jìn)血管收縮，上調(diào)許多促炎基因（如NF-κB，IL-6，TNF-α）的表達(dá)、促進(jìn)炎癥細(xì)胞增殖和抑制凋亡[3-4]。血清ACE活性的動(dòng)態(tài)改變提示肺血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的程度、內(nèi)皮損傷的動(dòng)態(tài)變化過程。有研究表明在肺部疾病中RAS發(fā)揮著重要作用，ACE在ALI患者的肺泡灌洗液中升高，且ALI死亡率與ACE基因水平呈正相關(guān)[5]。ACE同系物（ACE2）可通過抑制減少血管緊張素Ⅱ的含量，以拮抗ACE的作用[6-7]。有相關(guān)研究結(jié)果表明ACE抑制劑卡托普利可作為ALI的一個(gè)治療藥物，這表明腎素-血管緊張素系統(tǒng)在ALI的病理生理中起著核心作用，抑制ACE/血管緊張素Ⅱ/血管緊張素Ⅱ1R軸可以改善ALI的癥狀[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示A組動(dòng)物血清ACE在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中保持相對(duì)穩(wěn)定。B組動(dòng)物在0.5 h血清ACE活性開始升高，1 h時(shí)達(dá)到峰值，2 h后逐漸下降，但在ET注射4 h時(shí)仍保持在較高水平。具體的機(jī)制可能為：在ET所致肺損傷的早期，ET使內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞膜發(fā)生改變，促使分布于血管腔面的血管內(nèi)皮細(xì)胞質(zhì)膜和內(nèi)皮細(xì)胞小凹處的ACE被大量釋放入血，血清ACE活性升高；隨著ALI的逐漸進(jìn)展，肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器受損， 致使ACE的合成減少，同時(shí)ACE下游產(chǎn)物—血管緊張素Ⅱ使肺血管的張力增加，微血管靜水壓升高，并能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞收縮、增大細(xì)胞間距，使肺內(nèi)血管通透性增加，使血管循環(huán)ACE進(jìn)入肺泡腔可能導(dǎo)致血清ACE含量及活性均降低。在本實(shí)驗(yàn)中內(nèi)毒素組肺組織濕重/干重比值和肺水含量明顯高于對(duì)照組，病理結(jié)果提示肺組織血管內(nèi)皮細(xì)胞明顯腫脹，血栓形成，血管壁可見較多的中性粒細(xì)胞貼壁，肺泡腔出現(xiàn)滲出，水腫液形成，透明膜形成，上述結(jié)果表明內(nèi)毒素對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞有直接損傷作用。地塞米松組動(dòng)物血清ACE活性在0.5 h開始升高，1 h達(dá)到峰值，2 h后逐漸下降，與A組相比無顯著性差異（P＞ 0.05）。C組肺組織濕重/干重比值、肺水含量與B組比較明顯降低，病理結(jié)果示肺泡腔滲出、血管內(nèi)皮細(xì)胞水腫、出血、中性粒細(xì)胞貼壁現(xiàn)象明顯輕于B組。這表明地塞米松對(duì)內(nèi)毒素性ALI具有一定的保護(hù)作用，其保護(hù)機(jī)理可能與其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的直接保護(hù)作用有關(guān)，其相關(guān)機(jī)制可能是地塞米松具有穩(wěn)定內(nèi)皮細(xì)胞膜，降低肺微血管通透性，抑制炎癥細(xì)胞聚集等有關(guān)。

綜上，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，使用ET（700μg.kg-1）可以制作兔急性肺損傷動(dòng)物模型，地塞米松可以抑制ALI血清ACE的活性，降低肺組織濕重/干重比值、肺水含量，減輕肺組織病理損害。這在一定程度上提示地塞米松可以通過肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)ET所致的ALI產(chǎn)生一定的保護(hù)作用。

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