痛瀉安腸方對腹瀉型腸易激綜合征模型大鼠NGF/PLC-γ/TRPV1信號通路表達的干預效應*

韓亞飛 石 磊 賈博宜 毛堂友 郭 一 王允亮 謝添弘 陳 晨 譚 祥 李軍祥 △

（1.北京中醫藥大學，北京 100029；2.北京中醫藥大學東方醫院，北京 100078）

腹瀉型腸易激綜合征（IBS-D）為功能性胃腸道疾病，以腹痛、腹瀉為主要臨床表現，但缺乏可解釋的病理改變。目前，IBS-D的發病機制尚不明確，研究證實內臟敏感性增加是IBS-D發病的關鍵因素［1-2］。神經生長因子（NGF）作為重要的參與痛覺過敏的物質，介導的NGF/激活磷脂酶C-γ （PLC-γ）/瞬時受體電位香草酸亞型-1（TRPV1）信號通路在IBS-D的發病中發揮著重要作用。因此，本研究以NGF/PLC-γ/TRPV1信號通路為切入點，探討痛瀉安腸方治療IBS-D內臟高敏感性的作用機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠72只，SPF級，體質量（120±20） g，由斯貝福（北京）實驗動物科技有限公司提供，合格證號SCXK（京）2016-0002，飼養在北京中醫藥大學東方醫院動物中心，許可證編號SYXK（京）2014-0008。普通飼料適應性喂養1周。

1.2 試藥與儀器 痛瀉安腸方水煎劑（炒白術15 g，炮姜 9 g，炒白芍 12 g，烏梅 9 g，蜘蛛香 6 g，黃連 6 g，蟬蛻 6 g，0.5 g 生藥/mL），匹維溴銨片（得舒特），中藥飲片由北京中醫藥大學東方醫院中藥房提供，陽性藥物匹維溴銨由法國蘇威特制藥公司生產（批號H20070059）。乙酸（北京化學試劑公司，貨號CAS64-19-7）；液體石蠟 （北京化學試劑公司）；MEDEX中心靜脈導管 （單腔）（美國）；BARD-FOLEY雙腔兒科導尿管 （美國）；TRNzol總RNA提取試劑（天根生化科技有限公司，貨號DP405-02）；消除gDNA反轉錄試劑盒 （寶生物公司，貨號RR047B）、Perfect Real time染料法實時熒光定量試劑盒（寶生物公司，貨號RR82LR）、DL2000 DNA Marker（寶生物公司，貨號 3427Q）；RIPA 總蛋白提取試劑盒（Sigma公司，貨號Cat No.R0278）、苯甲基磺酰氟（Sigma公司，貨號 Cat No.PMSF-RO）、BCA 蛋白定量試劑盒（Sigma公司，貨號Cat.No.BCA1）；蛋白酶抑制劑 （Roche公司，貨號Cat No.11697498001）；GAPDH鼠單抗（天津銳爾康生物科技有限公司，貨號Cat No.REK0005）；山羊抗兔 IgG（H+L，）/HRP（Jackson公司，貨號 Cat No.111 035003）、山羊抗鼠 IgG（H+L）/HRP（Jackson 公司，貨號 Cat No.115035003）。實驗儀器：BT224S電子天平（德國Sartouris公司）；QL-902渦旋振蕩儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；NANODROP 2000分光光度計 （Therno scientific公司）；ABI7500熒光定量PCR儀 （美國Applied Biosystems公司）；NuPAGE蛋白電泳系統 （美國Thermo公司）；Centrifuge 5415D 離心機（Eppendorf公司）；MultiSkan3酶標儀（美國Thermo公司）；Mini Ge Tank電泳儀（Therno scientific公司）。

1.3 分組與造模 制備模型前運用隨機數字表法將大鼠分為空白組、模型組、痛瀉安腸方高劑量組（按正常人用標準計量2倍換算）、痛瀉安腸方中劑量組（按正常人用標準計量換算）、痛瀉安腸方低劑量組（按正常人用標準計量1/2倍換算）和匹維溴銨組，每組12只。空白組和模型組給予等體積0.9%氯化鈉注射液灌胃，中藥組給予痛瀉安腸方水煎劑13.20 g/（kg·d）、6.60 g/（kg·d）、3.30 g/（kg·d）灌胃治療，匹維溴銨組給予20mg/（kg·d）的水溶液等體積灌胃治療。模型制備方法如下。 1）冰醋酸灌腸：參照 AL-Chaer ED［3］的造模方法，將大鼠倒置，用石蠟將中心靜脈導管潤滑，將0.5%的冰醋酸經肛門插入距肛緣3～5 cm處，為防止冰醋酸漏出，用手按住肛門約1min，灌注量從0.2mL開始，逐漸增加至0.7 mL，持續2周。2）球囊直腸刺激：用石蠟將雙腔導尿管球囊端潤滑，經肛門插入距肛緣 2～3 cm 處，向球囊中充氣 1.5～2.0 mL/次，以大鼠出現腹部收縮為度，共擴張3次，同時給予夾尾刺激，持續時間3～5min，持續2周。在冰醋酸灌腸、球囊直腸刺激聯合夾尾刺激的同時予番瀉葉濃縮劑［0.5 g/mL）灌胃，給藥體積為 20mL/（kg·d）］，持續 4 周。

1.4 標本采集與檢測 末次給藥后，將大鼠禁食禁水24 h，用10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉，取距離大鼠肛門約8 cm處的結腸組織，放入凍存管內，經生理鹽水沖洗干凈后置于液氮內凍存，之后放入-80℃冰箱保存待測。1）一般情況：分別觀察大鼠的精神狀態、進食、體質量、活動情況、毛發及大便性狀等情況。2）內臟敏感性評價：腹壁撤退反射（AWR）評分檢測大鼠內臟敏感性。本實驗共42 d，分別于第28、42日對各組大鼠進行AWR評分，評分前將大鼠24 h禁食不禁水。具體操作：在10%水合氯醛（3mL/kg）腹腔注射麻醉狀態下，將石蠟油浸潤后的雙腔導尿管球囊端插入距肛緣約1.0 cm的位置，用膠帶將導管固定在大鼠尾巴根部，將其放入特制的透明觀察箱內，大鼠在該箱內不能轉身只能前后活動，待其適應30min后開始向球囊內充氣擴張腸道，容量分別為1.0、1.5、2.0 mL，每次間隔10 min。每只大鼠重復上述步驟3次，取3次的平均值。AWR評分標準［4］：0分，結直腸擴張刺激時大鼠情緒基本穩定；1分，給予刺激時變得開始不穩定，偶爾扭動頭部；2分，給予刺激時腹背部肌肉輕微收縮但腹部未抬離地面；3分，刺激時腹背部肌肉較強烈收縮并出現腹部抬離地面的情況；4分，腹部肌肉強烈收縮，腹部呈弓形，并把腹部、會陰部抬離地面。3）腹瀉評價：糞便Bristol分級評分和糞便含水量檢測大鼠的腹瀉情況。分別于第28、42日對實驗大鼠進行糞便Bristol分級評分，同期采集大鼠 4 h（8∶00～12∶00am）糞便并稱重（濕重），干燥后再稱重（干重），計算出各組大鼠在治療前后其糞便含水量的變化，正常組同期觀察。 糞便含水量（%）＝（濕重-干重）/濕重×100%。 糞便Bristol分級評分標準［5］：1 型分散的硬塊，如堅果；2 型臘腸狀，成塊的；3型臘腸狀，表面有裂縫；4型臘腸狀或蛇狀，光滑而柔軟；5型柔軟團塊，邊緣清楚；6型絨狀便，邊緣不清，或糊狀糞；7型水樣糞，無固狀物。4）結腸NGF、PLC-γ和TRPV1的檢測：采用Western blot檢測NGF、PLC-γ和TRPV1的表達。先進行蛋白提取，加入0.1 M PMSF母液，預冷RIPA蛋白抽提試劑，腸組織以100mg加入200μL裂解液為基準，充分勻漿，在冰上孵育30min，4℃離心，離心完成后取上清液；加入BSA標準液，檢測樣品蛋白含量；以RIPA調整蛋白濃度，根據目的蛋白的分子量，配制濃度為5%的濃縮膠，分離電泳，濕轉法進行轉膜，封閉，用3%BSA-TBST 稀釋一抗，NGF （1∶500），PLC-γ （1∶1000），TRPV1（1∶1000），用 5%脫脂奶粉-TBST 稀釋一抗種屬對應二抗，山羊抗兔IgG（H+L）HRP和山羊抗小鼠IgG（H+L）-HRP，（1∶20000），TBST 洗膜，定影；加 GAPDH鼠單抗，加入二抗，洗膜后進行凝膠圖像分析，最終得出數值。 5）結腸 NGF、PLC-γ、TRPV1mRNA 的檢測：采用 Real-Time PCR 檢測 NGF、PLC-γ、TRPV1 mRNA的表達。進行引物設計，用超純RNA提取試劑盒進行組織樣本RNA提取，使用NanoDrop ND-2000測定RNA濃度和純度，逆轉錄合成cDNA后再進行PCR擴增，以2-△△ct作為目地基因對數據進行相對定量分析。NGF、PLC-γ、TRPV1、GAPDH 引物序列見表 1。

表1 NGF、PLC-γ、TRPV1、GAPDH 引物序列

1.5 統計學處理 應用IBM SPSSStatistics 22.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，對符合正態分布且方差齊的數據，其組間差異采用單因素方差分析，繼以LSD-t檢驗方法進行兩兩比較，不服從正態分布或方差不齊的數據采用非參數檢驗，繼以Games-Howell檢驗方法進行兩兩比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 一般情況 實驗期間，各組無大鼠死亡。空白組大鼠精神狀態良好，反應靈敏，體質量增加，飲食正常，活潑好動，毛發光澤整齊，大便呈顆粒狀。造模開始第3日起，除空白組外，大鼠精神略顯萎靡，體質量增長緩慢或略下降，食量減少，活動減弱，毛發凌亂少光澤（個別大鼠伴見不同程度的脫毛情況），大便稀爛，肛門周圍被稀便沾染。經灌胃治療后，與模型組相比，各治療組大鼠精神狀況、毛發光澤、進食、活動情況及體質量等均有不同程度的好轉，糞便性狀由糊狀便最終轉為顆粒狀。

2.2 各組大鼠治療前后AWR評分比較 見表2。造模結束后，球囊充氣量為1.0mL時，低劑量、中劑量和得舒特組與空白組大鼠相比，AWR評分均升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；充氣量為1.5 mL時，與空白組大鼠相比，中劑量、高劑量組AWR評分存在差異（P＜0.05），模型組、低劑量和得舒特組AWR評分有顯著性差異（P＜0.01）；充氣量為2.0mL時，低劑量組與空白組大鼠相比，AWR評分升高（P＜0.05）。治療結束后，與空白組大鼠相比，模型組大鼠AWR評分均升高（P＜0.05或P＜0.01）。與模型組大鼠相比，球囊充氣量為1.0mL時，低劑量和高劑量組大鼠AWR評分均降低（P＜0.05）；充氣量為 1.5 mL 時，低、中、高劑量組和得舒特組大鼠AWR評分均明顯降低（P＜0.01）；充氣量為2.0mL時，低劑量和中劑量組大鼠AWR評分均降低（P＜0.05）。

表2 各組大鼠治療前后AWR評分比較（分，±s）

表2 各組大鼠治療前后AWR評分比較（分，±s）

與空白組同容量比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組同容量比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組 別 時間 2.0mL空白組 治療前 2.95±0.60（n＝12） 治療后 2.92±0.34模型組 治療前 3.48±0.50 1.0mL 1.5mL 0.75±0.27 1.72±0.68 0.80±0.19△ 1.83±0.19 1.38±0.61 2.88±0.58**（n＝12） 治療后 3.45±0.45*1.33±0.43* 2.92±0.24**低劑量組 治療前 1.47±0.50* 2.92±0.80** 3.62±0.45*（n＝12） 治療后 0.85±0.36△ 2.05±0.39△△ 2.98±0.34△中劑量組 治療前 1.50±0.70* 2.55±0.61* 3.38±0.53（n＝12） 治療后 1.00±0.34 1.88±0.27△△ 2.95±0.36△高劑量組 治療前 1.28±0.51 2.67±0.55* 3.42±0.61（n＝12） 治療后 0.90±0.36△ 2.00±0.34△△ 3.08±0.27得舒特組 治療前 1.45±0.70* 2.87±0.47** 3.50±0.58（n＝12） 治療后 0.93±0.33 2.12±0.55△△ 3.05±0.36

2.3 各組大鼠糞便Bristol分級評分比較 見表3。造模結束后，模型組和各治療組的大鼠糞便Bristol分級評分升高，且結果近似，與空白組比較差異均有統計學意義（P＜0.01）。治療結束后，與模型組比較，各治療組大鼠糞便Bristol分級評分均降低（P＜0.01），同時，其糞便Bristol分級評分與空白組接近。

2.4 各組大鼠糞便含水量比較 見表4。治療之前，模型組和各治療組大鼠糞便含水量的結果接近，與空白組相比，均有統計學差義（P＜0.01）。治療結束后，各治療組大鼠糞便含水量均低于模型組（P＜0.01），同時，其糞便含水量與空白組接近。

表3 各組大鼠糞便Bristol分級評分比較（分，±s）

表3 各組大鼠糞便Bristol分級評分比較（分，±s）

與空白組同期比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組同期比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。 下同。

組 別 n 第28日 第42日空白組 12 4.58±0.38 4.42±0.38模型組 12 6.25±0.27** 6.34±0.41**低劑量組 12 6.33±0.41** 4.50±0.45△△中劑量組 12 6.17±0.26** 4.75±0.27△△高劑量組 12 6.17±0.52** 4.58±0.58△△得舒特組 12 6.42±0.38** 4.67±0.75△△

表4 各組大鼠糞便含水量比較（%，±s）

表4 各組大鼠糞便含水量比較（%，±s）

組 別 n 第28日 第42日空白組 12 49.36±0.99 48.78±0.86模型組 12 62.24±1.31** 61.66±0.78**低劑量組 12 61.22±0.91** 50.11±3.16△中劑量組 12 60.08±1.15** 49.55±2.41△高劑量組 12 59.90±1.82** 50.24±1.43△得舒特組 12 60.67±2.08** 51.22±3.26△

2.5 結腸組織NGF、PLC-γ、TRPV1蛋白表達水平比較 見圖1，表5。治療結束后，與空白組相比，模型組大鼠結腸TRPV1蛋白表達升高（P＜0.05）；各治療組大鼠結腸組織中NGF、PLC-γ、TRPV1蛋白表達均低于模型組，其中，低劑量組大鼠結腸組織中NGF蛋白表達明顯低于模型組（P＜0.05）；與模型組相比，中劑量和高劑量組大鼠結腸組織PLC-γ蛋白表達明顯降低（P＜0.05）；低劑量和中劑量組TRPV1蛋白表達明顯低于模型組（P＜0.05或P＜0.01）；其余各組大鼠結腸組織蛋白表達與模型組無差異。

圖1 各組大鼠結腸蛋白表達

表5 各組大鼠結腸組織NGF、PLC-γ、TRPV1蛋白表達灰度值比較（目的蛋白/內參蛋白，±s）

表5 各組大鼠結腸組織NGF、PLC-γ、TRPV1蛋白表達灰度值比較（目的蛋白/內參蛋白，±s）

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2.6 結腸 NGF、PLC-γ、TRPV1mRNA的表達水平比較 見表6。治療結束后，與空白組相比，模型組大鼠結腸組織中 PLC-γ、TRPV1 mRNA表達明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，低劑量、高劑量、得舒特組大鼠結腸組織PLC-γmRNA表達明顯降低（P＜0.01）；與模型組相比，各治療組大鼠結腸組織TRPV1 mRNA表達明顯降低（P＜0.01）。

表6 各組大鼠結腸組織NGF、PLC-γ、TRPV1mRNA的表達比較（目的基因/內參基因，±s）

表6 各組大鼠結腸組織NGF、PLC-γ、TRPV1mRNA的表達比較（目的基因/內參基因，±s）

組 別 n TRPV1/2-△△ct空白組 6 1.26±0.26模型組 6 2.17±0.60**低劑量組 6 1.33±0.15△△NGF/2-△△ct PLC-γ/2-△△ct 1.11±0.58 0.93±0.17 1.09±0.12 5.38±1.29**1.75±0.41 1.63±0.29△△中劑量組 6 1.20±0.37△△1.27±0.44 2.15±0.84*高劑量組 6 1.38±0.52 1.30±0.28△△ 0.90±0.13△△得舒特組 6 0.96±0.20 0.86±0.14△△ 1.35±0.15△△

3 討 論

NGF是一種具有營養神經元和促進神經突起生長雙重生物學功能的神經細胞生長調節因子，對中樞及周圍神經元的發育、分化、生長、再生和功能特性的表達均具有重要的調控作用。近幾年研究發現，神經生長因子在疼痛的產生及維持過程中也扮演著重要角色。NGF可以由多種細胞合成釋放，蛋白酪氨酸激酶受體A（TrkA）是NGF的高親和力受體，通過激活PLC-γ通路，降低TRPV1開放閾值，參與介導過度敏感現象［6］，是IBS-D內臟敏感性增加的關鍵通路。研究表明，IBS-D患者與健康人相比，血清和腸黏膜的NGF及其受體TrkA含量均顯著升高；而靶向性抑制NGF能降低NGF和TrkA的水平，能有效改善IBS-D的內臟高敏感癥狀［7］。亦有研究顯示，NGF能誘導結腸過敏，阻斷NGF則能夠緩解其高敏感性［8］。

TRPV1是一種配體門控非選擇性的陽離子通道蛋白，對Ca2+具有高度通透性，能對細胞內或細胞外的機械性、溫度性和化學性刺激激活，產生痛覺過敏和病理性疼痛。作為痛覺感知傳導所必需的一個傷害性感受分子，在IBS內臟高敏感性發生中具有關鍵作用。臨床研究［9］顯示，TRPV1在 IBS患者乙狀結腸的表達較正常人更高，并與患者的腹痛嚴重程度呈正相關。實驗研究也發現感覺神經元TRPV1表達上調與內臟高敏感性疼痛的發生密切相關，是啟動并保持胃腸道高敏感性的重要分子［10-11］。TRPV1基因敲除可以降低胃腸道傳入神經在擴張刺激下的機械敏感性［12］。

反復的腹痛、腹瀉是IBS-D患者的主要臨床表現，而情緒的異常改變往往是其癥狀出現或加重的重要因素［13-14］。 根據患者“痛”“瀉”等的臨床表現，以及與情緒之間的密切聯系，中醫學將其歸屬于 “泄瀉”“腹痛”“郁證”等范疇，其病機關鍵在于脾虛肝旺，脾虛濕盛［15］，正如《醫方考》所記載“瀉則之脾，痛則之肝；肝則之實，脾則之虛，脾虛肝實，故令痛瀉”。痛瀉安腸方是導師李軍祥教授經過多年臨床總結的臨床經驗方，在IBS-D的治療中取得了顯著的療效，主要由炒白術15 g，炮姜 9 g，炒白芍 12 g，烏梅 9 g，蜘蛛香 6 g，黃連6 g，蟬蛻6 g組成。方中白術苦甘而溫，補脾燥濕以治土虛，為君藥；炮姜性溫，善暖脾胃，能溫中止痛止瀉，與白術共為君藥。白芍酸寒，柔肝緩急止痛，與白術相配，于土中瀉木；烏梅酸澀性平，能澀腸止瀉，與白術相配以收健脾止瀉之功；味酸入肝，與白芍相配則加強柔肝止痛之力，與白芍共為臣藥。蜘蛛香辛苦而溫，理氣止痛，除濕止瀉；黃連清熱燥濕，厚腸止瀉；蟬衣氣味甘寒，乃清虛之品，能祛風而勝濕，與黃連相配，防止濕邪入里化熱，與蜘蛛香、黃連共為佐藥。諸藥相伍，乃仿痛瀉要方之義，使脾健肝舒，氣機調暢，痛瀉自止。

本實驗結果顯示，IBS-D大鼠內臟敏感性閾值下降，糞便含水量和糞便Bristol分級評分均明顯升高，結腸組織 NGF、PLC-γ、TRPV1蛋白表達升高，結腸PLC-γ、TRPV1mRNA表達升高；痛瀉安腸方治療后內臟敏感性閾值升高，大鼠糞便含水量和糞便Bristol分級評分降低，且接近空白組，結腸組織NGF、PLC-γ、TRPV1蛋白表達下降，PLC-γ、TRPV1 mRNA 表達降低，說明痛瀉安腸方能上調內臟敏感性閾值，下調結腸組織NGF、PLC-γ、TRPV1蛋白表達，降低結腸PLC-γ、TRPV1mRNA的表達，達到治療IBS-D的目的。

但是實驗結果顯示，大鼠結腸組織中NGFmRNA的表達在治療前后并未發生改變，腸道功能的變化是否主要體現在蛋白的表達上以及基因是否參與腸道功能的變化仍需進一步驗證，NGFmRNA的表達是否與NGF的表達同步尚需進一步研究。

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