丹紅注射液激活AMPK保護心肌缺血再灌注損傷模型大鼠的實驗研究*

田 心 王淵博

（1.陜西省中醫醫院，陜西 西安 710003；2.沈陽軍區總醫院，遼寧 沈陽 110015；3.第四軍醫大學，陜西 西安 710032）

腺苷酸活化的蛋白激酶（AMPK）是調節細胞能量代謝的重要分子［1］，當細胞處于應激狀態時，胞內的AMP不斷堆積，由此激活AMPK。AMPK通過增加在胞內的葡萄糖轉運以及糖酵解，維持ATP濃度，而使細胞生存。丹紅注射液在臨床治療缺血性心臟病多年，療效良好。本實驗旨在闡明丹紅注射液保護心肌的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SD雄性大鼠由第四軍醫大學實驗動物中心提供。36只，體質量200～250 g，SPF級飼養條件，標準飼料喂養，動物合格證號：SCXK（軍）字第2007-007號。

1.2 試藥與儀器

丹紅注射液購自陜西步長制藥有限公司 （國藥準字：Z20026866，規格：10mL/支，批號：15041024）。兔抗p-AMPKα、AMPKα抗體購自美國abcam公司；肌鈣蛋白 T（TnT）、乳酸脫氫酶（LDH）的 ELISA 試劑盒購自AMEKO公司；酶標儀為美國Molecular Devises公司產品；倒置顯微鏡為日本Nikon公司產品；透射電鏡為日本JEOL公司產品；電泳系統及凝膠成像系統均為Bio Rad公司產品。

1.3 造模方法

用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠（1.5mL/kg），氣管插管，微型動物呼吸機給予正壓機械通氣，常規肢體Ⅱ導聯心電圖記錄心電活動，分離左側頸靜脈，經左側頸靜脈插管，建立給藥途徑；于大鼠胸骨左緣第4～5肋間開胸，暴露心臟，撕開心包膜，在左心耳下緣處穿線（6/0絲線），以備結扎冠狀動脈左前降支（LAD），用直徑約0.2 cm細塑料管穿過結扎線，以心電圖ST段明顯抬高、缺血數分鐘后出現明顯的心律失常作為心肌缺血標志。缺血30min，再灌注2 h。

1.4 分組與給藥［2］

將36只實驗大鼠隨機分為對照組、對照加丹紅組、缺血/再灌注組、缺血/再灌注加丹紅組。每組9只。為保證實驗質量，借鑒于文獻［2］研究發現的藥效時間點，最大藥效時間點為10 min，最小藥效時間點為60 min，按8 mL/kg于再灌注即刻到結束進行全程頸靜脈給藥；對照組及缺血/再灌注組給予等體積的無菌生理鹽水。

1.5 標本采集與檢測

1.5.1 ELISA檢測血清中TnT、LDH水平 12只大鼠心尖部穿刺取血，室溫放置1 h后，3000 r/min離心15 min，取上清液于-80℃冰箱凍存。按試劑盒要求操作，用酶標儀測定各組樣品的吸光度（450 nm）值（OD值），用標準品做標準曲線，并算出方程，將各組OD值代入進行計算出待測樣品的濃度值（至少重復3次）。

1.5.2 蘇木素堿性復紅苦味酸染色（HBFP）［3］之前12只大鼠取血完畢后，分別摘取心臟組織，于4%多聚甲醛中固定24 h，常規石蠟包埋切片。將組織切片常規脫蠟至水，明礬蘇木素浸染15 s，常規自來水沖洗5 min，后用0.1%堿性復紅液浸染3 mins，用蒸餾水輕輕沖洗10 s，然后用純丙酮浸泡8 mins，之后用0.1%苦味酸丙酮液分化20 s，至切片上無紅色洗脫為止；最后以二甲苯透明后用中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察。

1.5.3 透射電鏡觀察心肌線粒體形態 另12只大鼠實驗完畢后，心肌缺血再灌注后，將心臟切出，放置于呈有PBS溶液的容器內，擠壓出殘留于心腔內的血液。沿心臟長軸的左心組織結扎血管以下區域，剪裁下約2mm×3mm長條形的2塊心肌組織，放置2.5%的戊二醛中固定2 h，PBS漂洗3次，每次10min，1%鋨酸固定2 h，又以PBS漂洗，之后梯度乙醇脫水處理、浸透，再經過環氧樹脂的包埋處理。光鏡定位后超薄切片機切割其為厚度20 nm心肌組織切片，經鈾鉛等染色后，置于透射電鏡下，觀察心肌內線粒排列分布、線粒體大小改變、線粒體膜及線粒體嵴的結構變化情況。

1.5.4 蛋白免疫印跡（Western blot）檢測心肌組織中p-AMPKα/AMPKα的表達 余12只大鼠實驗完畢后摘取心臟，切取結扎線周圍心臟組織，用組織裂解液加蛋白磷酸酶抑制劑提取各組心肌組織蛋白，并進行蛋白定量，用SDS-PAGE進行電泳，并將其轉膜到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上，100 g/L的脫脂牛奶室溫封閉1 h后，滴加1∶800的抗p-AMPKα、AMPKα一抗孵育過夜，PBST 洗膜（5 min，5 次），再用 1∶5000 特異性二抗室溫孵育1 h后洗膜（5min，5次），進入發光儀器后滴加顯影液曝光后觀察結果，并利用Quantity One軟件對目的條帶分析獲取數據。

1.6 統計學處理

應用SPSS17.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，多組間兩兩比較采用組間t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠心肌缺血再灌注的血清TnT、LDH水平比較

見表1。心肌缺血再灌注時，TnT、LDH明顯升高（P＜0.01），使用丹紅注射液后，TnT、LDH明顯降低（P＜0.01），丹紅注射液可明顯減輕心肌缺血再灌注的TnT、LDH 水平。

表1 各組大鼠心肌缺血再灌注的血清TnT、LDH水平比較（±s）

表1 各組大鼠心肌缺血再灌注的血清TnT、LDH水平比較（±s）

與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與缺血再灌注組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。 下同。

組 別 n TnT（μg/L） LDH（ng/mL）對照組 3 13.44±2.48 27.96±2.45對照加丹紅組 3 12.82±2.88 28.03±1.93缺血再灌注組 3 37.83±5.94** 71.53±8.32**缺血再灌注加丹紅組 3 18.22±4.03△△ 33.49±3.40△△

2.2 各組大鼠心肌缺血再灌注心肌組織壞死情況比較

見圖1。對心肌組織的特殊染色分析可見：對照組和對照加丹紅組的心肌組織，用HBFP法染色可見心肌細胞呈黃色或黃棕色，細胞核呈藍褐色；缺血再灌注組的心肌組織中可見大片深紅色改變，而缺血再灌注加丹紅組心肌組織中可見深紅色改變明顯減輕，區域局限縮小。由此可見，丹紅注射液可以減少心肌缺血再灌注的壞死。

2.3 各組大鼠缺血再灌注心肌細胞線粒體損傷情況比較

見圖2。大鼠缺血區域心肌組織的透射電鏡圖片顯示：對照組和對照加丹紅組的心肌細胞線粒體排列整齊，呈融合狀；缺血再灌注組的心肌細胞線粒體呈腫脹改變，部分線粒體分裂明顯，呈空泡狀改變；缺血再灌注加丹紅組的心肌細胞線粒體其病態改變減輕，線粒體排列較整齊。由此可見，丹紅注射液可減輕缺血再灌注心肌細胞線粒體損傷。

圖1 大鼠的心肌組織切片（HBFP染色，100倍）

圖2 大鼠心肌細胞線粒體的透射電鏡成像（10000倍）

2.4 各組大鼠缺血/再灌注心肌AMPK的磷酸化水平比較 如圖3，表2。結果示，正常大鼠心肌中，加用丹紅注射液 的p-AMPKα/AMPKα 水平升高 （P＜0.05）；缺血再灌注時，AMPK激活，p-AMPKα/AMPKα水平升高（P＜0.01）；缺血再灌注時，給予丹紅注射液治療，AMPK進一步激活，較單純缺血再灌注p-AMPKα/AMPKα水平升高（P＜0.05）；說明丹紅注射液可以上調缺血再灌注心肌AMPK磷酸化水平。

圖3 丹紅注射液對心肌p-AMPKα/AMPKα表達的Western Blot圖

表2 各組心肌細胞p-AMPKα/AMPKα表達比較（±s）

表2 各組心肌細胞p-AMPKα/AMPKα表達比較（±s）

組 別 n 灰度比（p-AMPKα/AMPKα）對照組 3 0.51±0.11對照加丹紅組 3 0.92±0.20*缺血再灌注組 3 1.31±0.18**缺血再灌注加丹紅組 3 2.32±0.57**△

3 討 論

基于缺血性心臟病的病理生理中，缺血缺氧為其最基本的病變，由此而引發心肌氧供與需求的失衡，AMPK經典的激活機制定義為細胞能量狀態受AMP/ATP和ADP/ATP的比值影響［4］。在再灌注中，也就是當氧供再補充時，AMPK誘導的糖酵解有害地影響自由脂肪酸代謝，從而在再灌注過程中阻礙了心臟豐富的ATP產生能力［5］。然而，AMPK激活的純粹作用是有益的，Kim等［6］證實在LAD閉塞小鼠中，用藥物激活AMPK時，梗死面積減小，心臟機能得到更好的保護，同時也發現凋亡和壞死減輕。線粒體為細胞能量代謝供氧、ATP，其結構和功能改變對心血管生理和病理起著關鍵作用［7］。采用有效藥物干預保護心肌細胞線粒體是近年來心血管領域研究的熱點。

丹紅注射液是臨床上使用最多的活血化瘀類中藥注射劑之一［8-9］。丹紅注射液目前已明確的有效物質為丹參素、原兒茶醛、羥基紅花黃色素A、迷迭香酸、丹酚酸B等7種物質［2］。其主要成分與血漿蛋白結合率均＞60%，其組分間的相互競爭影響較小［10］。早期研究發現［11-12］，丹紅注射液主要成分改善氧化應激所致的線粒體損傷，防止線粒體質子ATP酶水解，顯示良好的保護作用；同時丹紅注射液有減輕缺血再灌注心肌血管內皮炎癥，促進血管內皮細胞增殖、改善血管內皮功能紊亂的作用［13］。 已有報道［14］丹紅注射液能夠減輕缺血再灌心肌細胞凋亡，且與濃度有一定的依賴關系。丹紅注射液其有效應用在神經系統疾病亦有報道，丹紅注射液具有保護腦出血大鼠神經系統功能和減輕腦水腫的作用［15］，且丹紅注射液對大鼠腦缺血/再灌注損傷的治療時間窗應在4 h內，機制與抗氧化有關［16］。但丹紅注射液對AMPK的激活作用卻尚未報道，因此本研究應用較特殊的HBFP病理染色和心肌酶學指標，以及基礎的免疫印跡法和電鏡技術闡述了丹紅注射液減輕缺血再灌注心肌及線粒體損傷是通過激活AMPK來實現的。

綜上所述，丹紅注射液能夠激活缺血再灌注心肌AMPK信號通路，發揮能量調控作用，保護心肌損傷及線粒體損傷，本基礎研究局限于丹紅注射液激活AMPK信號通路，我們下一步將闡述其對AMPK信號下游分子的影響及具體保護機制。

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