雞源產氣莢膜梭菌分離株的生物學特性鑒定

王啟琛 ， 鄒開宇 ， 王守春 ， 王 平 ， 杜 菲 ， 徐守振 ， 尹燕博

(1.青島農業大學動物科技學院 ， 山東 青島 266109 ； 2.青島澳蘭百特生物工程有限公司 ， 山東 青島 266101)

產氣莢膜梭菌(C.perfringens)是引起各種動物壞死性腸炎、腸毒血癥以及人類的食物中毒和創傷性氣性壞疽的主要病原菌之一。目前，它被發現α，β，ε，δ，θ，κ，λ等共計12種毒素，而α、β、ε和t 是主要的致死性毒素，基于魏氏梭菌產生的主要致死毒素與其抗毒素的中和試驗，將菌株分成A，B，C，D和E 5種類型，其毒素均能造成人類或動物感染某些疾病，引起組織損傷[1]。

雞壞死性腸炎(Necrotic enteritis)是由A型或C型產氣莢膜梭菌引起的雞腸道壞死、出血的一種常見病，在全國范圍內普遍存在，對中國的養雞業造成諸多潛在威脅。隨著抗生素使用越來越嚴格，每年家禽壞死性腸炎的發病率持續上升[2]。本研究從山東萊西、安丘、泰安等地送檢的疑似壞死性腸炎的病雞腸道中分離鑒定了3株A型雞源產氣莢膜梭菌，并對其生物學特性進行了初步研究，為雞壞死性腸炎的診斷和防控提供依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 TSB肉湯、血瓊脂、硫酸亞鐵牛乳培養基等，購自青島海博生物科技有限公司；DNA質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒，購自上海生工生物工程技術服務有限公司；瓊脂糖、PCR反應試劑，購自TaKaRa公司；微生物發酵反應管、藥敏紙片，購自杭州天和微生物試劑有限公司；2.5 L厭氧袋、厭氧罐，購自日本三菱瓦斯化學株式會社；PCR儀，購自杭州朗基科學儀器有限公司；SPF雞胚，購自北京梅里亞維通實驗動物有限公司；屏障系統動物房和隔離器由青島澳蘭百特生物工程有限公司提供。

1.2 分離培養和形態觀察 收集病變腸道，用75%酒精擦拭腸道外壁，接種環刮取腸道內壁，接種在綿羊血瓊脂平板上，在37 ℃的溫箱中厭氧培養24 h。挑取疑似的雙層溶血環菌落，進行涂片，革蘭染色、鏡檢。對分離的3株菌株分別命名AQ01，KD02，TA03并純化保存備用。

1.3 生化特性鑒定 分離菌分別接種于葡萄糖、山梨醇、乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘露醇、明膠、山梨醇、鼠李糖、硝酸鹽等生化反應管，37 ℃厭氧培養24 h，進行生化鑒定；牛乳發酵試驗，觀察是否出現牛乳洶涌發酵現象。

1.4 毒素分型 分離菌分別接種TSB肉湯并厭氧培養24 h，取1.5 mL培養液于離心管中，提取細菌基因組DNA。參考文獻[5]合成5對引物(見表1)：cpa、cpb、etx、iap、cpb2，分別擴增產氣莢膜梭菌的α、β、ε、ι、β2毒素。多重PCR反應體系如下：10×PCR Buffer 3.0 μL，10 mmol/L dNTP 2.5 μL，25 mmol/L MgCl24.0 μL，上下游引物各0.5 μL，rTaq酶0.5 μL，模板DNA 2 μL；最后用ddH2O補足到30 μL。PCR反應程序：94 ℃ 5 min、95 ℃ 30 s、49 ℃～54 ℃ 30 s(第一個循環退火溫度為54 ℃，然后每隔4個循環降1度，直至退火溫度降為49 ℃)、72 ℃ 1 min，共進行32個循環，72 ℃延伸10 min。PCR產物用1%凝膠瓊脂糖進行電泳，觀察結果。

1.5 α毒素基因與16S rRNA基因分析 分別用擴增cpa(k)和16S rRNA基因的引物克隆α毒素基因和16S rRNA基因，PCR產物純化后分別連接到T載體，陽性克隆產物送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。在NCBI下載5種類型產氣莢膜梭菌型代表株的參考序列(登錄號為AY823400.1、D10248.1、D32123.1、D32126.1、D32127.1、D49969.1、D32128.1、X17300.1)，用DNAStar軟件對分離株和參考株序列進行α毒素基因同源性分析；用MegAlign軟件構建16S rRNA基因系統發育樹，進行遺傳進化分析。

表1 目的基因擴增引物

1.6 藥敏試驗 根據美國臨床和實驗室標準協會(CLSI)的標準進行藥敏試驗[3]。挑取單個菌落接種TG培養基，37 ℃厭氧24 h培養。將其用滅菌棉簽均勻涂布于TSC瓊脂平板，稍干后再用無菌鑷子將藥敏紙片貼在普通營養瓊脂平板表面，37 ℃厭氧培養24 h后測量各藥物抑菌圈的大小(mm)，根據抑菌圈直徑大小判斷分離菌株對各種藥物的敏感程度:抑菌圈直徑小于10 mm為耐藥(R)，10～15 mm為中度敏感(I)，大于15 mm為高度敏感(S)。

1.7 SPF雞致病性試驗 采用活菌計數法確定3株產氣莢膜梭菌攻毒菌液的活菌濃度為8×109CFU/mL，口腔灌服21日齡SPF雞(每組15只)，0.5 mL/只，對照組灌服相同劑量的無菌生理鹽水，連續觀察7 d。按照上述方法從病死雞的肝組織和腸道中分離鑒定產氣莢膜梭菌。

2 結果

2.1 細菌分離培養結果 血瓊脂平板經37 ℃厭氧培養24 h后可見灰白色、邊緣整齊、圓形表面光滑菌落，直徑2mm～4 mm，菌落周圍可見溶血環(見中插彩版圖 1 A)。革蘭染色鏡檢可見陽性粗大桿菌，兩端鈍圓，多單個存在，大小為0.7m～1.3m×1.5m～7m，未見芽胞，符合魏氏梭菌菌落特征(見中插彩版圖 1 B)。

2.2 生化鑒定結果 3株分離株均發酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖，產氣產酸，不發酵山梨醇、甘露醇、鼠李糖，液化明膠，牛乳爆裂。

2.3 毒素分型結果 多重PCR對分離株毒素分型結果顯示，3株菌均僅擴增出惟一1條約325 bp大小的α毒素目的條帶(見中插彩版圖 2)，表明三分離株均為A型產氣莢膜梭菌。

2.4 α毒素和16s RNA基因分析結果 對α毒素基因序列分析顯示，分離菌AQ01和KD02、AQ01和TA03、KD02和TA03間α毒素核苷酸同源性分別為98.9%、98.7%、99.3%，氨基酸序列同源性分別為98.7%、98.7%、99.5%；分離株α毒素編碼398個氨基酸，與其他分離株和參考株序列相比， TA03株362位點由Pro突變為Ser，KD02株162位點由Tyr突變為His、137位點Gln缺失；3分離株與參考菌株α毒素核苷酸序列同源性為97.6%～99.9%，氨基酸同源性為96.5%～99.7%。16S rRNA系統進化分析顯示，AQ01與KD02親緣關系很近，屬于同一分支，TA03屬于單獨一個分支。

圖3 α毒素氨基酸同源性分析

圖4 16S rRNA基因系統進化分析

2.5 藥敏試驗結果 藥敏試驗結果顯示，3株分離菌株均對慶大霉素、卡那霉素、新霉素、多黏霉素B、復方新諾明表現出耐藥性，均對頭孢唑啉、頭孢曲松、頭孢呋辛、氨芐青霉素、哌拉西林藥物表現出高度敏感性，對紅霉素、克林霉素、丁胺卡那霉素等藥物表現出不同程度的敏感。

2.6 SPF雞致病性試驗結果 3株分離株攻毒21日齡SPF雞7 d后，TA03、AQ01、KD02死亡率分別為100%、60%和10%，毒力強弱依次為TA03、AQ01、KD02。剖檢病死雞可見壞死性腸炎典型病變特征，肝臟變黑變脆、易破裂，有大小不一凹陷(見中插彩版圖5 A)；腸道臌氣，腸壁變薄，腸道黏膜部分出血顯著或壞死(見中插彩版圖5 C)；對照組無任何病變(見中插彩版圖5 B、 D)。從病死雞的肝臟和腸道中又可分離出產氣莢膜梭菌。

3 討論

近年來，產氣莢膜梭菌引起的雞壞死性腸炎給養殖戶造成嚴重經濟損失，尤其表現在腸壁上大量出血、壞死，容易被誤認為流感、球蟲病或新城疫的病變，易延誤病情，造成更大損失。雞壞死性腸炎主要由A型產氣莢膜梭菌引起，偶見C型，多發于冬季，雞源產氣莢膜梭菌臨床病原分離情況逐年增加。本試驗鑒定的3株產氣莢膜梭菌均分離于冬季發病種雞和肉雞，寒冷季節為病毒和細菌提供了有利的生存環境，經常會引發混合感染，導致壞死性腸炎發生。

A型產氣莢膜梭菌主要致死性毒素是α；B型菌主要致死性毒素是α、β、ε；C型菌主要致死性毒素是α、β；D型菌主要致死性毒素是α、ε；E型菌主要致死性毒素是α、t。根據多重PCR擴增毒素用于魏氏梭菌分型見于很多研究報道[4-7]。本試驗3株雞源產氣莢膜梭菌分離株經多重PCR均鑒定為A型致病性產氣莢膜梭菌。藥敏試驗結果顯示，3株分離菌株均對慶大霉素、卡那霉素、新霉素、多黏霉素B、復方新諾明表現出耐藥性，對頭孢類、青霉素類、氧氟沙星等藥物表現出高度敏感性。耐藥性除環丙沙星不同，其余藥敏試驗結果與艾地云等[8](2014)A型梭菌藥敏試驗結果基本相似，與據張艷等[9](2015)藥敏試驗結果有差異，這能跟雞場的用藥史有關，長時間單一用藥可能使細菌出現耐藥性。

產氣莢膜梭菌α毒素是引起動物發病死亡的重要原因之一，近年來對α毒素的plc基因有很多研究[10]。本試驗分離株間的α毒素氨基酸同源性高，為98.7%～99.5%，但分離株部分位點出現變異和缺失，其中TA03株362位點由Pro突變為Ser，KD02株162位點由Tyr突變為His、137位點Gln缺失。Nagahama等[11]和Guillouard等[12]研究發現，產氣莢膜梭菌的致病性與α毒素基因的缺失改變有關。本試驗攻毒結果顯示，分離株的致病力存在一定差異性，毒力強弱依次為TA03、AQ01、KD02，這些氨基酸的改變是否關系到菌株毒力的改變，需進一步研究。16S rRNA基因序列是細菌的相對保守的一段序列，其在分析、鑒定細菌進化及親緣性方面具有檢測速度快等優勢，是常規的細菌鑒定和培養方法無法比擬的。16S rRNA系統進化分析發現，AQ01與KD02親緣關系很近，屬于同一分支，TA03與其他兩株親緣關系相對較遠。

目前，A型產氣莢膜梭菌引起的雞壞死性腸炎對山東地區規模化養雞業造成越來越嚴重的經濟損失。本試驗通過對山東部分地區雞源A型產氣莢膜梭菌分離株的生物學特性的鑒定發現，雞源A型產氣莢膜梭菌的致病性有增強的跡象，且對之前的敏感藥物產生了不同程度的耐藥性，應當引起高度重視。

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