致雛雞腹瀉病原的分離鑒定與藥敏試驗

常超越 ， 張召興 ， 閆艷娟 ， 賈青輝 ， 李蘊玉 ， 張香齋 ， 李佩國

(河北科技師范學院 河北省預防獸醫學重點實驗室 ， 河北 秦皇島 066604)

2016年9月，秦皇島市大蒲河鎮某養雞場，24日齡的雛雞出現了扎堆，進而大群采食量下降，排黃、白、綠色稀便，肛門周圍有糞便污染，鼻腔周圍偶有泡沫樣分泌物，每天死亡20只左右。對病死雞進行了剖檢，無菌采集病料組織分離了2種病原菌，并命名為QHE-1和QHS-1，通過鑒定，分離株QHE-1、QHS-1分別鑒定為大腸桿菌、沙門菌。對其分離的2株菌進行了耐藥性分析，以便為該地區大腸桿菌與沙門菌混合感染引起雛雞腹瀉的防治提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 病料來源 對秦皇島市大蒲河鎮某養雞場死亡的雛雞進行剖檢，無菌采集具有典型病理變化的肝臟、心血、腎臟等病料組織。

1.2 主要試劑 普通瓊脂培養基、營養肉湯，購自青島高科技工業園海博生物技術有限公司；藥敏紙片，購自北京天壇藥物生物技術開發公司；美藍染色液試劑盒，購自青島高科技工業園海博生物技術有限公司；微量發酵管，購自杭州天和微生物試劑有限公司；ID32E腸道菌鑒定試條，購自法國梅里埃公司；DL-2 000 Marker、2×TaqMarker Mix、樹脂型TM基因組DNA提取試劑盒，均購自北京康為世紀生物科技有限公司；7%綿羊脫纖血液瓊脂培養基由本實驗室自制，常規的試劑及儀器有本實驗室提供。

1.3 細菌分離 將無菌采集的病死雞的肝臟、心血、腎臟等病料組織，劃線接種于鮮血瓊脂培養基，37 ℃恒溫培養12～16 h，選取優勢生長菌分別接種于S.S.瓊脂培養基和麥康凱培養基上，37 ℃恒溫培養12～16 h。通過鑒別培養后，分別接種于普通培養基純化培養后，挑取純化培養后優勢菌落接種在營養肉湯中200 r/min 37 ℃恒溫震蕩培養，并革蘭染色，顯微鏡下觀察細菌形態。

1.4 生化鑒定 按鑒定試劑條說明書進行操作，用自動生化鑒定系統進行生化試驗。

1.5 細菌基因組DNA的提取及16S rRNA PCR的擴增與測序 用營養肉湯培養的菌液，按照樹脂型TM基因組DNA提取試劑盒說明書進行提取基因組DNA，16S rRNA基因組DNA通用引物，P1 5′-CCGTCTTCAGTTCCAGTGTG-3′，P2 5′-GTGGCGGACGGGTGAGTAA-3′，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，以提取的基因組DNA為模板，經行PCR反應。將PCR產物送上海生工生物工程技術服務有限公司進行序列測定，測序結果與GenBank數據庫中登錄基因序列進行同源性比較分析。

1.6 致病性試驗 將24日齡雛雞分為3組，每組4只，第1、2組為試驗組，每只雛雞分別腹腔注射分離菌株QHE-1和QHS-1，劑量為0.25 mL(108CFU/mL)；第3組接種等量的營養肉湯作為陰性對照。接種12 h后，觀察7 d，記錄發病及死亡情況，對于死亡的雛雞剖檢，進行分離鑒定

1.7 紙片法藥敏試驗 按照美國臨床檢驗標準委員會(NCCLS)推薦的標準K-B紙片法進行試驗操作和結果判斷。

2 結果

2.1 病理變化 剖檢可見嗉囊流出有酸臭味的內容物，氣管壁粘有白色黏液，心包有黃色膠胨樣滲出，腺胃彌漫性出血，肝臟腫大發黃伴有纖維素性滲出，十二指腸片狀出血。發病時間較長者可見腎臟腫大。

2.2 細菌培養特性和形態特征 從送檢病死雞的肝臟、心血、腎臟等病料組織中分離到2種優勢菌落，在血液瓊脂培養基分別呈灰白色、表面光滑中等大小和粉紅色、圓形隆起、光滑濕潤、邊緣整齊的菌落。分離菌株QHE-1在麥康凱培養基可見邊緣光滑整齊、濕潤的、扁圓型、粉紅色菌落及邊緣整齊的小菌落；分離菌株QHS-1在S.S.瓊脂培養基可見無色半透明菌落,部分菌落中間帶黑色。革蘭染色QHE-1呈兩端鈍圓革蘭陰性桿狀菌，QHS-1中等大小、兩端略圓的直桿狀革蘭陰性菌。與報道大腸桿菌和沙門菌培養特性和形態特征一致。

2.3 細菌生化特性鑒定 分離菌株QHE-1能分解鼠李糖、麥芽糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇；木糖和阿拉伯糖并產酸產氣，吲哚和甲基紅反應成陽性，V-P試驗呈陰性，經ATB自動生化儀鑒定為大腸桿菌，評定結果合格率為 99.5%。分離菌株QHS-1能發酵葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、枸櫞酸鹽; 不發酵乳糖、蔗糖、尿素；吲哚試驗呈陰性，產生H2S，經ATB自動生化儀鑒定為沙門菌，評定結果合格率為 98.5%。

2.4 細菌基因組DNA的提取及16S rRNA PCR的擴增與測序 用16S rRNA的通用引物對分離菌株QHE-1和QHS-1進行了PCR 鑒定，均擴增出大約為1 492 bp左右的的目的條帶(見圖1)。與GenBank DNA序列數據庫中基因序列進行比對，分離菌株QHE-1與大腸桿菌的參考株同源性為99.9%，分離菌株QHS-1與沙門菌參考株同源性為99.6%。

圖1 分離菌株QHE-1和QHS-116S rRNA PCR擴增結果

2.5 致病性試驗 試驗組雛雞在攻毒12 h后逐漸出現死亡，其中，QHE-1攻毒組死亡率100%(4/4)，QHS-1攻毒組死亡率75%(3/4)，剖檢后進行分離鑒定，結果顯示，所分離菌株與QHE-1和QHS-1一致。對照組4只雛雞健康存活，表明分離菌株QHE-1和QHS-1對雛雞均具有一定致病性。

2.6 耐藥性分析 由表1可知，分離菌株QHE-1和QHS-1均對阿米卡星、頭孢克肟、頭孢曲松3種藥物敏感， QHE-1株對恩諾沙星、大觀霉素、氟苯尼考3種藥物中敏；對其他存在耐藥； QHS-1株對恩諾沙星、林可霉素、氟苯尼考3種藥物中敏；對其他存在耐藥。

表1 分離菌株QHE-1和QHS-1藥敏試驗結果

注：S: 敏感; I: 中敏; R: 耐藥