某公園狼偽狂犬病的診斷

王賀偉 ， 劉書梅 ， 陳瑞利 ， 李進萍 ， 王雙山

(1.河南省安陽市動物衛生監督所 ， 河南 安陽 455002 ； 2.安陽工學院生物與食品工程學院 ， 河南 安陽 455000 ；3.河南省安陽市人民公園 ， 河南 安陽 455001)

2017年1月3日，安陽市某公園1只1歲母狼死亡，疑似偽狂犬病(PR)，前來就診。經流行病學調查、病理解剖學及實驗室綜合診斷，確診為狼偽狂犬病。隨后采取了防控措施，沒有出現新的病例。本文通過臨床和實驗室綜合診斷確定該病由偽狂犬病病毒引起，提示動物(公)園在飼養狼及其他犬科動物時，應該重視該病的預防，采取綜合的管理和防制措施，有效預防和減少因感染該病而導致發病和死亡。

1 病例介紹

該公園飼養狼6只，近兩年來沒有發生不明原因死亡。2017年1月3日上午，飼養員發現1只狼口吐白沫，呼吸困難，呈現腹式呼吸、呼吸音粗厲、不斷后退且轉圈運動。逐漸發展為呻吟不安，陣發性抽搐，四肢麻痹，發病后約6 h死亡。

飼養員介紹：未出現過類似病情。該狼發病前1天，精神狀態、營養狀況、體質、飲食情況等均與其他狼無異，死前沒有發現有外界因素的干擾；飼料來源于安陽市某屠宰廠的豬肉胴體，飲用水為公園統一供應。

2 病理剖檢

對送檢狼進行剖檢，尸體脫水，皮膚干癟。肝有明顯的出血點和壞死點(見中插彩版圖1)，小腸(見中插彩版圖2)、大腸彌漫性出血(見中插彩版圖3)，肺臟水腫、充血。腦膜水腫、充血、出血，脊髓積液增多(見中插彩版圖4)。其他器官僅見輕微眼觀病變。

3 實驗室診斷

3.1 細菌鑒定 無菌采取死亡狼的肝臟、脾臟、淋巴結和肺臟組織涂片鏡檢，未見細菌。同時接種血液瓊脂平板和麥康凱瓊脂平板進行細菌分離培養，37 ℃培養48 h觀察，亦未見細菌菌落。

3.2 動物試驗

3.2.1 病料處理 采集狼大腦、脾臟、肺臟以及扁桃體等不同部位的樣品，混合后在研磨器中進行充分研磨，然后加入1∶10倍含有濃度分別為1 000 mg(μg)/mL青霉素和鏈霉素的無菌生理鹽水，放進冰箱中，反復凍融3次，再在離心機上進行離心，取上清液放置冰箱后備用。

3.2.2 試驗觀察 將4只健康兔分為對照組2只和試驗組2只，然后進行編號和標記。試驗組分別在頸部皮下接種上述病料的上清液2 mL，對照組分別在頸部皮下接種無菌生理鹽水2 mL。接種后進行觀察和體溫測定。

3.2.3 動物試驗結果 試驗組兔體溫升高到41.8 ℃，精神沉郁、呼吸急促。隨后接種部位奇癢，兔子興奮不安、尖叫，舔咬頸部接種部位，用頸部摩擦兔籠，以致被毛脫落、皮膚損傷出血，直至完全麻痹，3 d死亡。 2只試驗兔子病情相同。死后剖檢，大腦充血、出血，并采取病料做PCR檢測。對照組隔離觀察7 d，均沒有出現任何癥狀。

4.3 PCR檢測

4.3.1 DNA提取 分別無菌采取狼、動物試驗死亡兔的，腦、扁桃體和肺3個部位樣品約1 g，放入滅菌試管中，再加10 mL無菌生理鹽水，再用分散機進行充分研磨直至無塊狀物，制成混懸液，然后分別將混懸液轉至1.5 mL滅菌離心管中，8 000r/min離心2 min，取0.2 mL上清于1.5 mL滅菌的離心管中。用深圳市康百得生物科技有限公司生產的豬偽狂犬病病毒PCR檢測試劑盒，按操作說明書提取上清液中的DNA。

4.3.2 PCR反應 按上述PCR試劑盒說明書要求操作。總體積為20 μL，含16 μL PCR反應液(A液)、2 μL混合酶(B液)、2 μL模板DNA。PCR反應循環參數為： 94 ℃ 3 min ；循環94 ℃ 30 s、65 ℃ 45 s、72 ℃ 30 s，共 40次；再72 ℃延伸10 min。

4.3.3 PCR結果 分別取狼、兔2個PCR產物10 μL進行1%瓊脂糖凝膠電泳。電泳結果顯示，采取狼和兔的臟器樣品，進行PCR均擴增出220 bp大小的特異性條帶，與陽性對照相符，陰性對照則沒有出現目的條帶，表明所檢測病料PRV陽性，結合臨床癥狀、病理剖檢、細菌分離和動物試驗，可診斷狼為PR感染。如圖5。

圖5 狼、試驗死亡兔病料組織PRV PCR電泳檢測結果

5 討論

本次對公園死亡狼采用綜合臨床診斷和實驗室診斷，確診死狼為狼偽狂犬病。狼并不是偽狂犬病病毒(PRV) 的原發宿主，目前普遍認為豬是PRV 主要的自然宿主和儲存宿主，而且長期帶毒和排毒的動物，在偽狂犬病的傳播上起著重要的作用。近年 PR 在豬群中廣泛流行，其他動物的偽狂犬病發病率在逐年上升，這與PR 在豬群中廣泛流行有密切關聯。而其他動物主要通過食入鼠類，或家畜、鼠類尸體和尿液污染的飼料感染。該狼可能是生食帶PRV的豬肉軀體感染而死亡。

在試驗動物中，兔、豚鼠、小鼠等對PR均有易感性。在基層實驗條件差的情況下，可采用兔做實驗動物診斷PR，此法簡便易行，技術要求不高，但必須遵循實驗規則。

目前，該病尚無理想的特效藥及治療方法，其豬主要依靠免疫接種滅活疫苗或基因缺失苗來防控豬偽狂犬病，起到了較好的預防效果。但狼相對于豬對 PRV 更加敏感，商品用豬偽狂犬病疫苗對狼的安全性仍待商榷。因此，建議動物園(公園)對該病應引起重視并采取綜合防控措施：(1)必須加強對飼料的管理，尤其是豬的副產品應熟喂，嚴禁飼喂來源不明的飼料；(2)加大對環境的衛生消毒力度、做好滅鼠工作，切斷該病傳播途徑；(3)必要時可以考慮借鑒羊預防PR的辦法，進行接種商品用豬偽狂犬病滅活疫苗。