芩丹顆粒對熱損傷雄性大鼠生殖功能的影響

高俊濤 ， 馮憲敏 ， 萬 朋 ， 呂士杰 ， 任 曠 ， 朱文赫 ， 駱曉峰

(1.吉林醫藥學院生理學教研室 ， 吉林 吉林 132013 ； 2.吉林醫藥學院病原生物學教研室 ， 吉林 吉林 132013 ；3.吉林醫藥學院微波輻射損傷防護中心 ， 吉林 吉林 132013 ； 4.吉林醫藥學院低壓低氧與健康研究中心 ， 吉林 吉林 132013)

高溫環境對機體功能產生危害[1]，特別是導致男性不孕不育癥發病率逐年升高。高溫導致精子發育及雄性生殖功能異常[2]，目前對高溫引起的雄性生殖功能損傷尚缺乏特效的治療方法，芩丹顆粒具有減輕高溫暴露大鼠熱損傷的作用[3-4]。因此，本試驗分別從大鼠性行為能力和氧化應激水平等方面來研究芩丹顆粒減輕熱應激大鼠生殖功能損傷作用，為高溫環境對生殖系統的影響及防治措施提供思路和方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組 選擇清潔級Wistar大鼠100只，雄性，體重180±20 g，由吉林大學動物實驗中心提供。實驗動物隨機分為5組，即正常對照組、模型組，芩丹顆粒大、中、小劑量組每組20只。進入熱倉前，芩丹顆粒大、中、小劑量組大鼠分別灌胃給芩丹顆粒10 g/kg、20 g/kg、40 g/kg體重，正常對照組和模型組大鼠給予等體積生理鹽水，連續30 d。

1.2 儀器與試劑 DKB-501S型超級恒溫水浴，Hitachi 7600生化分析儀，BiopacMP150多通道生理記錄儀，BA300型數碼生物顯微鏡,酶標儀，MuseTM細胞分析儀；SOD、GSH-PX和MDA檢測試劑盒，均購自南京建成生物技術研究所(批號：20150628)。芩丹顆粒為本院自制(規格10 g/袋，批號：150401)，其主要組成包括黃芩、黃芪、丹皮、梔子等，其中主要成分為黃芩苷，梔子苷和丹皮酚，生理鹽水溶解，4 ℃保存。

1.3 大鼠熱損傷模型制備 使用超級恒溫水浴，連接有機玻璃夾層水循環艙，保持艙溫42 ℃。將大鼠置于大小合適固定器中，放入熱倉，1 h/d，連續14 d，正常對照組除不接受熱暴露外，其他處理與模型組相同。

1.4 相關指標的檢測

1.4.1 性行為能力的觀察 分別于熱應激7 d和14 d，參照Anders Agmo[5]方法進行，雄性大鼠的第一次撲捉時間即撲捉潛伏期，同時觀察雄性大鼠在30 min內對雌性大鼠的撲捉次數。

1.4.2 精子相對計數測定 分別于熱應激7 d和14 d后，取出雙側附睪中的精子，在顯微鏡下計數精子數。涂片經固定、染色后在鏡下觀察。收集細胞使用MuseTM細胞分析儀檢測精子死亡率。

1.4.3 血清SOD、GSH-PX和MDA檢測 分別于熱應激的7 d和14 d后，經大鼠腹主動脈取血，按照說明書進行氧化損傷指標的檢測。

2 結果

2.1 芩丹顆粒對熱應激雄性大鼠性行為的影響 與正常對照組比較，熱應激7 d、14 d后大鼠的撲捉潛伏期顯著延長、撲捉次數顯著減少(P<0.05)。與模型組比較，芩丹中劑量組(P<0.05)，芩丹大劑量組(P<0.01)撲捉潛伏期顯著縮短，撲捉次數顯著增加(見表1)。

表1各組熱應激第7、14天大鼠CIP、Ct比較

組別nCIP(s)第7天第14天Ct(次/30min)第7天第14天正常對照組1028.15±3.2328.63±2.7141.11±2.4542.34±2.17模型組1046.82±2.52*47.04±3.37**26.85±2.21*23.25±2.44**芩丹小劑量組1045.38±1.8046.18±3.0127.54±2.4824.17±3.07芩丹中劑量組1038.21±2.63#38.37±4.37#31.62±2.47#35.12±3.37#芩丹大劑量組1030.57±2.57##31.55±2.07##39.72±3.51##39.41±4.53##

注：與正常對照組比較，*：P<0.05；與模型組比較，#：P<0.05； s：秒

2.2 芩丹顆粒對熱應激雄性大鼠精子的影響 與正常對照組比較，熱應激7 d、14 d后大鼠的精子相對計數明顯減少(P<0.05)，精子畸形率明顯增加(P<0.05)。與模型組比較，芩丹中劑量組(P<0.05)，芩丹大劑量組(P<0.01)精子相對計數顯著增加(P<0.05)，精子畸形率顯著減少(見表2)。

表2各組熱應激第7、14天大鼠精子相對計數、畸形率、精子存活率比較

精子相對計數(×106/mL)畸形率/%精子存活率/%組別n第7天第14天第7天第14天第7天第14天正常對照組10198.33±33.59194.26±30.287.03±1.467.23±1.1996.11±3.3296.25±4.18模型組10166.32±40.16*161.52±39.05*16.21±1.52*18.58±1.56*88.08±2.13*85.12±3.06*芩丹小劑量組10167.23±36.38162.55±37.5116.22±1.7217.95±1.5689.16±1.4588.05±2.75芩丹中劑量組10176.72±33.86#172.43±39.75#9.88±1.51#13.27±1.53#93.03±1.43#92.38±1.69#芩丹大劑量組10197.25±42.37#190.27±38.57#7.58±1.16#7.98±1.37#94.92±3.02##93.17±2.81##

注：與正常對照組比較，*：P<0.05；與模型組比較，#：P<0.05，##：P<0.01

2.3 芩丹顆粒對熱應激雄性大鼠血清中SOD、GSH-PX活性和MDA含量的影響 與正常對照組比較，熱應激7 d、14 d后大鼠的SOD、GSH-PX的活性顯著降低(P<0.05)，MDA的含量顯著增加(P<0.05)。與模型組比較，芩丹中劑量組(P<0.05)，芩丹大劑量組(P<0.01)SOD、GSH-PX的活性顯著增加，MDA的含量顯著增加(見表3)。

表3各組熱應激第7、14天大鼠血清SOD、GSH-PX活性和MDA水平比較

SOD(U/mL)GSH-PX(U/L)MDA(μmol/L)組別n第7天第14天第7天第14天第7天第14天正常對照組10395.28±36.12383.04±36.31325.32±10.57328.17±11.387.26±1.127.87±1.12模型組10297.25±32.43*292.46±32.72*229.08±23.18*226.28±50.43*12.89±1.56*15.66±1.35*芩丹小劑量組10302.17±35.22305.85±36.15231.72±11.15229.72±12.5311.58±1.6115.28±1.25芩丹中劑量組10345.53±35.17#349.15±35.26#298.13±12.98#288.50±19.25#9.12±1.62#13.03±1.76#芩丹大劑量組10375.26±36.19##375.56±40.15##317.22±17.29##311.28±15.36##7.8±1.33##10.13±1.57##

注：與正常對照組比較，*：P<0.05 ；與模型組比較，#：P<0.05,##：P<0.01

A：正常對照組； B：模型組； C：芩丹小劑量組；D：芩丹中劑量組； E：芩丹大劑量組

3 討論

我們以往的研究表明，芩丹顆粒具有減輕熱損傷和微波輻射損傷的作用[4,6]。嚴重的高溫環境，導致機體缺血缺氧并產生過量的氧化自由基，最終導致多器官功能障礙[7]。熱應激對雄性生殖系統產生不良的影響，易出現過熱而造成睪丸損傷。本研究表明，持續高溫環境可引起精子活力下降，畸形率增加，存活率降低等。研究表明，熱應激能夠引起代謝改變，從而影響雄性生殖系統[2]。熱應激過程中睪丸和生精細胞產生的過氧化物與精子的生理功能有關[8]。過氧化傷害引起精子膜脂質過氧化，導致雄性不育。MDA是過氧化脂質的分解產物，可反映體內自由基產生的程度。SOD、GSH-Px反映機體的抗氧化能力。本試驗結果表明，高溫環境暴露的過程中熱應激可以隨時間和強度聚集，導致精子的相對數量減少而精子的畸形率增加，模型組大鼠血清SOD、GSH-Px的活性均較正常對照組降低而MDA含量顯著升高，芩丹顆粒能夠提高精子的相對數量，降低精子的畸形率和死亡率，提高血清SOD、GSH-Px的活性，降低MDA含量，這些結果提示，芩丹顆粒能改善熱應激對雄性大鼠生殖系統的影響，其作用機制可能與減輕生殖細胞的氧化損傷有關。

[1] Das R, Sailo L, Verma N,etal. Impact of heat stress on health and performance of dairy animals: A review [J]. Vet World， 2016,9(3):260-268.

[2] Hou Y, Wang X, Lei Z,etal. Heat-stress-induced metabolic changes and altered male reproductive function[J]. J Proteome Res，2015, 14(3):1 495-1 503.

[3] 高俊濤，萬朋，王春艷，等. 芩丹顆粒對熱損傷大鼠心功能的保護作用[J]. 環境與健康雜志，2016，33(1)：73-75.

[4] 高俊濤，萬朋，王春艷，等.芩丹顆粒減輕高溫暴露大鼠熱損傷的作用及機制[J]. 山東醫藥，2016，56(2)：11-13.

[5] Anders Agmo. Male rat sexual behavior[J]. Brain Res Protoc 1997，1(2):203-209.

[6] 呂士杰，雷鈞濤，任曠，等.芩丹扶正膠囊的制備及其抗微波輻射損傷效應[J].中國臨床康復,2010,10(31):111-113.

[7] Sheng-Hsien Chena, Mao-Tsun Lin,Chang C P.Ischemic and oxidative damage to the hypothalamus may be responsible for heat stroke [J].Current Neuropharmacology, 2013,11(2): 129-140.

[8] Rockett J C, Mapp F L, Garges J B,etal. Effects of hyperthermia on spermatogenesis, apoptosis, gene expression, and fertility in adult male mice[J]. Biology of Reproduction, 2001,65(1): 229-239.