同型半胱氨酸及亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態性與缺血性卒中的關系研究

張露，崔曉燕，張博愛，3

缺血性卒中（ischemic stroke，IS）是腦血管病最常見的類型，約占全部腦血管病的三分之二[1]。近年來大量研究表明，血漿同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）水平增高是缺血性卒中的獨立危險因素[2]。Hcy水平增高可受多種因素影響[3]，其代謝的關鍵酶亞甲基四氫葉酸還原酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）起關鍵作用，其中以MTHFR基因C667T堿基突變最常見[4]。MTHFR C667T基因突變是否與IS有關，目前國內外研究結果尚不一致。本研究采用酶循環法和聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）-基因芯片檢測IS患者和無缺血性腦血管病對照者血漿Hcy水平及MTHFR C667T基因多態性分型，探討其與IS的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2014年6月-2016年2月于鄭州大學第一附屬醫院神經內科及神經介入科確診為IS的住院患者（IS組），選擇同期無缺血性腦血管病病史，于醫院其他科室住院患者為對照組。

納入標準：IS組符合：①1995年第4屆全國腦血管病學術會議修訂的IS診斷標準；②首次卒中，急性期；③經頭顱磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）和（或）電子計算機斷層掃描（computed tomography，CT）檢查確診。對照組要求無心腦血管疾病病史。

排除標準：IS組排除有出血轉化、心源性腦栓塞者；對照組排除任何腦血管疾病、下肢靜脈血栓、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、重度抑郁者等；兩組均排除有惡性腫瘤、器官功能衰竭、肝腎功能異常、甲亢、癲癇等疾病者。

1.2 方法

1.2.1 分組與分析指標 按照以上納入和排除標準，分為IS組和對照組，比較兩組平均年齡和吸煙者、飲酒者、高血壓患者、高血脂患者、糖尿病患者比例構成。其中，飲酒定義為近一年每周平均飲酒3次及其以上者；吸煙定義為每日吸煙1支及以上，連續吸煙1年及以上者[5]。分析兩組MTHFR C667T基因型、血漿Hcy水平的差異及Hcy與血清VitB12、葉酸水平的相關性。

1.2.2 血漿Hcy水平及血清VitB12、葉酸濃度的檢測 所有患者均于清晨空腹采集外周靜脈血2 ml于乙二胺四乙酸鈉抗凝管中，酶循環法檢測血漿Hcy水平，免疫分析法檢測血清VitB12和葉酸濃度。

1.2.3 基因型的檢測 用PCR-芯片雜交法檢測MTHFR C667T基因型多態性，共3種基因型：CC（酶活性高，葉酸轉化能力高）、CT（酶活性中，葉酸轉化能力中等）、TT（酶活性低，葉酸轉化能力低下）（圖1）。

圖 1 MTHFR C667T 3種基因型

1.2.4 血漿Hcy水平與VitB12及葉酸之間的相關性排除近3個月內服用VitB12、葉酸制劑而影響相關指標者。將IS組與對照組分別進行Hcy與VitB12及葉酸水平的相關性分析。

1.3 統計學方法 采用SPSS 21.0軟件進行統計處理。符合正態分布的計量資料采用表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Bonferroni檢驗。不符合正態分布的計量資料用中位數和四分位數表示。計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗。血漿Hcy水平與VitB12及葉酸之間的相關性采用Spearman分析。P＜0.05認為有統計學意義。對基因頻率在人群中的分布進行Hardy-Weinberg平衡適合度檢驗。檢驗水準取α=0.05，P＞0.05認為基因頻率分布差異無顯著性。

2 結果

2.1 一般資料 研究共納入IS組217例，其中短暫性腦缺血發作（transient ischemic attack，TIA）患者15例，缺血性卒中患者202例，年齡36～83歲。對照組納入了223例，年齡40～84歲。IS組平均年齡和吸煙、高血壓病、糖尿病的比例均顯著高于對照組，兩組性別、飲酒者和高脂血癥的比例差異無顯著性（表1）。

2.2 兩組血漿Hcy水平檢測結果 IS組血漿Hcy水平為（23.95±12.13）μmol/L，顯著高于對照組（17.31±7.20）μmol/L（t=29.61，P＜0.001）。

2.3 Hardy-Weinberg 平衡吻合度檢驗 IS組（χ2=0.0170，P=0.918）和對照組（χ2=0.000，P=1.000）基因頻率均符合Hardy-Weinberg平衡，具有人群代表性。

2.4MTHFR C667T基因多態性及等位基因頻率分布 IS組CC（31例）、CT（97例）、TT（89例）3種基因型分布頻率分別為14.3%、44.7%、41.0%，對照組CC（41例）、CT（109例）、TT（73例）3種基因型分布頻率分別為18.4%、48.9%、32.7%，兩組基因型頻率差異無顯著性（χ2=3.59，P=0.166）。兩組CC+CT與TT基因型分布頻率差異無顯著性（χ2=3.24，P=0.072）。IS組MTHFR基因C、T等位基因頻率分別為36.6%、63.4%，對照組C、T等位基因頻率分別為42.8%、57.2%，差異無顯著性（χ2=3.52，P=0.061）（表2）。

2.5MTHFR C667T基因型多態性與血漿Hcy濃度的關系 缺血性卒中患者組CC、CT、TT基因型對應的平均血漿Hcy水平分別為（16.65±6.90）μmol/L、（18.21±8.08）μmol/L及（25.19±12.53）μmol/L，差異有顯著性（F=490.49，P＜0.001），其中TT基因型Hcy水平明顯高于CC及CT基因型，CT基因型顯著高于CC基因型（均P＜0.001）。

2.6 血漿Hcy水平與VitB12及葉酸的相關性分析IS組排除最近服用過含VitB12及葉酸的藥物后共有88例患者，Hcy、VitB12及葉酸水平分別為15.7（12.9，19.54）μmol/L、280.00（217.00，353.00）pmol/L及4.00（3.00，5.10）ng/L，血漿Hcy水平與VitB12和葉酸水平均呈負相關（rs分別為-0.431和-0.507，P均＜0.001）。對照組中排除最近服用過含VitB12及葉酸的藥物后有125例，Hcy、VitB12及葉酸水平分別為15.7（12.9，19.54）μmol/L、320（265.00，447.00）pmol/L、5.4（3.9，7.1）ng/L，血漿Hcy水平與VitB12和葉酸水平均呈負相關（rs分別為-0.489和-0.446，均P＜0.001）。

3 討論

Hcy是人體內的一種含硫氨基酸，是甲硫氨酸和半胱氨酸代謝的重要中間產物，1969年McCully[6]的研究顯示其為心血管疾病的獨立危險因素。Ashjazadeh等[7]開展的一個病例對照研究顯示，相對正常對照組，矯正傳統危險因素后高Hcy血癥（血漿Hcy＞15 μmol/L）引起卒中的比值比（odds ratio，OR）為2.17[95%可信區間（confidence interval，CI）1.24～3.79]。本次研究結果中IS組血漿Hcy水平明顯高于對照組，差異有顯著性，也驗證了該結論。

研究顯示，Hcy可能通過影響機體凝血、血小板功能、血管平滑肌細胞反應、內皮功能等導致動脈血栓形成[8]。Hofmann[9]研究表明，高Hcy血癥可通過增強血管中核轉錄因子（nuclear factor kappa B，NF-NB）的活動來調節一系列基因的表達，從而破壞機體自我穩態中抗炎和抗血栓機制。通常情況下，Hcy在體內有4種代謝途徑，其中一種是Hcy在甲硫氨酸合成酶的作用下，以VitB12為輔助因子，以N5-甲基四氫葉酸為甲基供體生成L-甲硫氨酸，參與甲硫氨酸循環，最終分解為丙酮酸、硫酸和水，隨尿液排出體外[10]。本研究結果表明，缺血性卒中和無卒中的對照組Hcy水平與VitB12及葉酸均呈負相關，分析其原因可能是體內VitB12和葉酸缺乏導致了甲硫氨酸循環障礙，從而使Hcy在體內蓄積。目前，已有研究證實葉酸能效降低血漿Hcy濃度[11]。Zeng等[12]Meta分析亦表明，補充葉酸對葉酸低攝入地區高Hcy血癥的發病有輕度預防作用；而單獨補充VitB12降低血漿Hcy水平效果不明顯，只有同時補充葉酸才能顯著降低血漿Hcy水平。

N5-甲基四氫葉酸在N5-N10-MTHFR的催化下形成，MTHFR基因的突變可降低該酶的活性，引起血漿Hcy水平的增高。流行病學研究顯示，MTHFR基因（C667T）T等位基因突變可解釋血漿Hcy水平總變異的6%[13]，MTHFR基因多態性被認為是心腦血管疾病危險因素的候選基因[14]。MTHFR基因有多個突變位點，至少有7個位點易發生C→T突變，位于第四位外顯子C667T位點突變最為常見。有研究發現，MTHFR C677T雜合子酶活性僅為野生型的30%，可導致純合子血漿Hcy濃度較雜合子及野生型明顯升高[15]。在本研究中，所有患者的TT基因型Hcy平均水平明顯高于CC及CT基因型，CT基因型高于CC基因型，差異均具有顯著性。故推薦血漿Hcy水平異常增高的患者做MTHFR C667T基因型測定，以指導治療。

表1 缺血性卒中組與和對照組一般臨床資料的比較

表2 MTHFR C667T基因型頻率分布

MTHFR C667T基因突變是否是IS的危險因素，目前尚有爭議。Konrad等[16]通過配對的病例對照研究認為，MTHFR C667T基因多態性與IS沒有關系。馬濤[17]亦得出相同結論。然而，Harbuzova等[18]和Li等[19]的研究則認為MTHFR C667T基因多態性是IS的危險因素。本次研究結果顯示，CC、CT、TT三種基因型分布頻率、C、T等位基因頻率在IS組與對照組中的差異不具有顯著性，提示MTHFR C667T基因突變可能不是IS的危險因素，分析原因可能為IS的發生是遺傳和環境多種因素相互作用的一個復雜過程，與傳統的危險因素相比較而言，MTHFR C667T基因的作用可能受到基因與基因的相互作用，轉錄、翻譯過程中的修飾以及蛋白質之間的相互作用的影響。Tasdemir等[20]通過檢測599例IS患者和100例正常對照者7種具有促血栓形成危險的候選基因的基因型認為，MTHFR C667T基因突變在IS的發生中不具有重要作用。

綜上所述，這次較大樣本的病例對照研究結果提示IS患者血漿Hcy水平偏高，MTHFR C667T基因突變、體內葉酸與VitB12水平降低均可使Hcy水平升高，但未發現MTHFR C667T基因突變與IS有關系。本研究屬于醫院內病例對照研究，可能存在住院選擇偏倚。另有研究認為，在基因相關性研究中，尤其是在進行進一步的亞組分析時，要建立可靠的結論，每組需要至少1000例樣本量[21]。因此，后續研究仍需進一步大規模多中心的隊列研究。

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【點睛】本研究證實了缺血性卒中患者血漿Hcy水平偏高，MTHFR C667T基因突變、葉酸和VitB12水平降低是血漿Hcy水平升高的影響因素，而MTHFR C667T基因突變與缺血性卒中無關。