皮瓣缺血再灌注損傷相關細胞信號通路總結

吳玉偉，金培生

（1徐州醫科大學研究生院，江蘇 徐州 221004 ；2徐州醫科大學附屬醫院整形外科，江蘇 徐州 221002）

目前主要認為缺血再灌注損傷（IR）的機制有以下幾個方面：活性氧損傷、炎癥反應、鈣超載、能量代謝障礙、細胞凋亡、血液循環障礙等。IR是多因素綜合作用的病理生理過程，涉及多種分子機制調控，如何防治皮瓣IR是整形外科的重要課題。目前，涉及皮瓣缺血再灌注損傷過程相關的細胞信號轉導通路的研究不斷的深入，但對其相關研究進展的總結、分析較少。運用計算機檢索萬方數據庫及Pubmed數據庫，中文關鍵詞為“皮瓣缺血再灌注損傷，信號通路，凋亡，氧化應激，炎癥反應，微循環，鈣超載”，英文關鍵詞為“ischemia and reperfusion of skin flap，signal pathway，apoptosis，oxidative stress，inf l ammatory reaction，microcirculation，calcium overload”，查閱納入文獻包括基礎、臨床研究及綜述，進行資料初審，排除重復、陳舊性文獻，保留經典文獻，選擇2005年至2017年間有代表意義文獻，納入35篇符合標準的文獻。最終選擇36篇文獻對皮瓣缺血再灌注損傷過程中相關的細胞信號通路進行闡述并總結、分析。

1 活性氧損傷相關信號通路

皮瓣缺血再灌注過程可產生的大量活性氧（ROS）， ROS產生的有害因子與機體抗氧化防御系統的消耗共同導致細胞功能障礙代謝及活性、細胞膜、蛋白質和DNA等的改變，導致氧化與抗氧化間失衡，最終使細胞死亡。

絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）家族由5種亞 類：ERK1/2、JNK、p38、ERK3/4、ERK5組成，ROS激活的MAPKs信號通路主要包括p38、JNK1、JNK2基因表達增加，p‐ERK1、ERK2、p‐ERK2蛋白表達增加。P38 MAPK信號通路主要介導調控細胞內的炎癥反應、氧化應激反應過程、凋亡等多種細胞反應[1]，有動物實驗表明，抑制P38 MAPK后大鼠皮瓣組織中ROS、丙二醛（MDA）、高級氧化產物（AOPP）[2]、8-羥基-2’-脫氧鳥苷（8-OHdG）量均下降[3]。抑制P38 MAPK可增加一些氧化還原敏感型基因如超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）基因的表達，使細胞產生預適應，對氧化應激抵抗力增強，從而減輕皮瓣IR。

硫氧還蛋白（Trx）是與SOD系統同樣重要的調節細胞內氧化還原平衡的抗氧化系統[4-5]。Trx‐1可有效地清除ROS，發揮抗氧化的生理功能。Das K C，Kundumanisridharan等人發現Trx能夠通過MKK4‐NF‐κB 途徑上調 SOD 的表達[6]，而0過表達能夠增強Trx系統的抑制氧化應激損傷功能[7]，因而SOD系統和Trx系統在抗氧化和清除ROS機制上協同，預防性給予rhTrx‐1可進入組織細胞內發揮抗氧化作用，緩解氧化還原失衡，Trx可作為預防和治療皮瓣IR的潛在的靶點。

Nrf2/Keap1‐ARE是目前最重要的抗氧化應激內源性通路。核因子E2相關因子2（Nrf2）可誘導依賴性抗氧化反應元件（ARE）啟動表達多種抗氧化酶類基因，正常生理狀態下Nrf2為低水平轉錄活性，在發生氧化應激、創傷時可誘導 Nrf2轉位入核內激活啟動下游多種抗氧化、抗炎等相關靶基因的轉錄。研究表明過氧化物酶體增殖激活受體（PPARγ）參與氧化應激反應，經配體激活后的PPARγ有較強的抗氧化活性，增強細胞抗氧化能力，從而抑制或減輕細胞凋亡，PPARγ還可與Nrf2、FOXO、Wnt/β‐catenin等信號通路有聯系，Nrf2的表達可能是通過PPARγ其上游而被激活，Nrf2和PPARγ之間形成正反饋的環路[8]。蛋白激酶（PKC）信號通路在體內、外氧化應激條件下可通過直接磷酸化而激活Nrf2，磷酸化后的Nrf2，促進 Nrf2轉位于胞核內并促使反式激活ARE。機體受到高水平ROS刺激時下游抗氧化酶表達水平的變化可能與MAPKs信號通路的激活相關，MAPKs可直接磷酸化Nrf2，激活 Nrf2 促進ARE的活化，而MAPKs、Nrf2信號通路在參與調控炎癥[9]、凋亡[10]、氧化應激[11]等方面發揮重要作用。磷脂酰肌-3-激酶（PI3K）/不典型蛋白激酶C（aPKC）信號通路參與激活Nrf2和調節抗氧化基因，該通路激活Nrf2，引起Nrf2核轉位上調谷氨酰半胱氨酸合成酶mRNA和蛋白質的表達提高其活性增加谷胱甘肽合成對抗氧化應激，而起到維持氧化與抗氧化平衡的作用。

FOXO屬于叉頭轉錄因子亞家族成員[12]，可調控細胞凋亡、糖類代謝、應激反應抵抗等不同環境條件下細胞的反應進程[13]。FOXO在氧化應激反應過程中可誘導錳型超氧化物歧化酶（MnSOD）基因表達及調節過氧化氫酶（CAT）的表達，此外，FOXO信號途徑可減少線粒體ROS的產生，通過cAMP‐PKA‐CREB‐PGC1α 通路促進線粒體增殖，起到保護線粒體結構和功能的作用[14]。

2 炎癥反應相關信號通路

皮瓣IR過程會激活炎癥反應過程、促進炎癥因子的釋放、表達，譬如核蛋白因子κB（NF‐κB）、白細胞介素 ‐6（IL‐6）、腫瘤壞死因子 ‐α（TNF‐α）的表達[15]，它們是缺血再灌注損傷過程中炎癥反應的重要介質。

P38 MAPK信號通路下游重要的轉錄因子NF‐κB是炎癥反應的關鍵信號傳導因子在炎癥反應中起重要作用，通過信號通路的級聯激活而增加NF‐κB的表達，促進其轉位進入細胞核內，進而啟動表達多種炎癥介質[16-17]。NF‐κB 還可誘導趨化因子、粘附分子‐1(ICAM‐1) 、血管細胞黏附分子‐1(VCAM‐1)、炎性酶等基因表達使炎性反應級聯放大。TNF‐α啟動子中有κB的結合位點，NF‐κB活化后轉位入核，與多種目的基因序列結合，啟動激活炎性因子基因的轉錄。活化的TNF‐α、IL‐1可促使表達NF‐κB，這樣靶細胞因子TNF‐α、IL‐1 與NF‐κB之間形成正反饋的環路。研究表明，同屬MAPK家族的p38、ERK、INK三者協同作用增加TNF‐a基因表達，TNF‐α 可通過引起IFN‐γI、L‐10等釋放，JAK/STAT通路被激活后，細胞表達高遷移率族蛋白‐1（HMGB1），產生 HMGB1 又促使釋放TNF‐a，不斷地放大炎癥效應，最終導致細胞、組織廣泛損害。應用NF‐κB 活化抑制劑和抑制JAK‐STAT、P38 MAPK通路可減輕炎癥反應。TLRs（Toll樣受體家族）是廣泛分布在免疫細胞表面的一類模式識別受體，現被認為是缺血誘導性炎癥主要的因素。Toll4/NF‐κB 信號通路中 TLR4/髓樣分化蛋白88（MyD88）依賴性途徑是激活胞內NF‐κB 主要信號通路[18-19]，受體與配體結合后再結合連接蛋白MyD88，從而激活腫瘤壞死因子受體相關因子‐6(TRAF6)，TRAF‐6活化后使IRAK、IRAK‐2連接于NF‐κB 誘導激酶 (NIK)，從而激活NIK使得α、β激酶進一步活化，IκB絲氨酸位點以磷酸化方式導致IκB發生泛素化而降解，NF‐κB與IκB結合的抑制狀態被解除，NF‐κB 激活轉位入核內，啟動激活細胞因子（TNF‐α、IL‐1、IL‐6、IL‐8、IL‐12）、黏附分子（CD80、CD86）等基因的轉錄，引起級聯反應，產生炎性細胞因子，而這些因子又可反饋性激活TLR4，從而導致損傷進一步加重。TLR4信號通路激活NF‐κB，增強炎性細胞因子表達，促使中性粒細胞浸潤并到組織聚集，導致組織器官發生I/R，可通過調控TLR4信號通路中間重要環節減輕皮瓣IR炎癥。

PHD-HIF分子通路中氧敏感脯氨酰羥化酶(PHD)是廣泛存在于組織細胞質中的基礎酶類，其可在有氧環境中羥化合成核因子NF‐κB的關鍵酶IKKβ而致其失活，使NF‐κB的合成、入核減少，從而抑制NF‐κB相關炎性細胞因子的表達。缺氧誘導轉錄因子(HIF)是炎性因子中重要的一種，NF‐κB 在核內大量聚集，導致組織細胞HIF蛋白的表達明顯增加，同時促進中性粒細胞、內皮細胞合成炎性介質（表達IL‐1、IL‐6、TNF‐α、IFN‐γ等）和趨化因子，從而介導組織細胞的炎癥損傷和壞死[20]。

3 細胞凋亡相關信號通路

皮瓣IR后細胞死亡的重要方式為細胞凋亡。P38 MAPK信號通路與凋亡密切相關，陳拓等[21]發現P38蛋白激酶抑制劑SB202190干預組中大鼠皮瓣組織中Bcl‐2的mRNA表達量、蛋白表達量均顯著高于模型組，Bax、半胱氨酸天冬氨酸酶3（Caspase 3）的mRNA表達量、蛋白表達量均顯著低于模型組，這說明抑制P38 MAPK能夠抑制移植皮瓣IR過程中的細胞凋亡。

水蛭素可有效的提高淤血皮瓣的成活率，凝血酶與蛋白酶激活受體（PARs）的結合由于天然水蛭素與凝血酶競爭性結合而抑制，從而阻斷PARs/p38 MAPK/IKK/NF‐κB 信號通路，使得 Bax 的表達抑制，下調Caspase3活化水平以及Bax/Bcl‐2 比值，從而起到了抗細胞凋亡作用[22]。

Trx‐1是多條細胞凋亡通路的關鍵調節因子。在胞質中還原型Trx‐1與凋亡信號調節激酶1（ASK1）直接結合，抑制其磷酸化激活，從而抑制ASKMAPK途徑相關的細胞凋亡和炎癥反應過程，同時Trx‐1可使caspase 3穩定性增強，防止caspase 3被剪切而被激活，從而抗細胞凋亡。Trx‐1 作為皮瓣IR損傷的藥物干預靶點具有治療價值和臨床應用前景。

細胞信號上游調節因子ROS 可激活其下游氧化還原狀態敏感性ASK1等不同信號分子，進而激活其效應分子MAPK。ASK1激活后可通過MKK4/MKK7激活應激活化激酶（JNK）從而參與組織器官的缺血再灌注損傷。JNK 可通過多種途徑誘導細胞凋亡，一方面可通過激活特定的轉錄因子上調促凋亡基因的表達；另一方面，通過影響Bcl‐2家族蛋白的功能調控細胞凋亡。應用JNK特異性抑制劑SP600125抑制c‐Jun 氨基末端激酶信號通路可減輕大鼠缺血/再灌注模型皮瓣細胞凋亡，Bai等[23]在大鼠腹部皮膚缺血/再灌注模型應用SP600125 后，發現SP組皮瓣存活面積大，血流灌注多，caspase‐3 活性降低 ,pAsk1 和 pJNK的低表達和Bcl‐2高表達水平,Bax顯著下降,提示皮瓣細胞凋亡受到了抑制。

PI3K/Akt信號通路具有細胞內源性保護作用，是重要的抗凋亡通路之一。激活PI3K/Akt信號通路對皮瓣IR具有保護作用，Akt可正調節轉錄因子NF‐κB、Bcl‐2，Bcl‐2是PI3k/Akt下游凋亡蛋白，磷酸化Akt可抑制Bad的凋亡作用，同時也可促進Bcl‐2的抗凋亡作用，Akt通過對凋亡、抗凋亡基因表達的影響，并且通過Bad 直接磷酸化，維持細胞的生存。

4 微循環相關信號通路

血管內皮細胞和血管平滑肌是血液微循環的基礎，微循環障礙是皮瓣IR損傷的重要機制。糖尿病缺血皮瓣模型通過移植脂肪干細胞(ASCs)，發現可激活HIF‐1α/VEGF通路，增強VEGF蛋白表達，促進新血管形成，通過改善缺血皮瓣的微循環血流灌注保護皮瓣[24]。局部移植 ASCs可促進創面愈合、皮瓣成活，而ASCs參與組織再生主要通過分泌血管生成因子（VEGF等）和調節內源性血管形成、血管生成[25-26]。Song 等發現Akt/c‐myc 通路可能與介導ASCs分泌VEGF相關[27]。內皮細胞Akt的激活，可增加生成NO起到維持內皮細胞功能層的作用，從而減輕血管損傷。因此，在皮瓣IR缺血、炎癥、氧化應激的環境中移植入 ASCs分泌表達相應生長因子，發揮保護皮瓣的作用。Xu等[28]發現丹參酮IIA（TSA）預處理后，皮瓣組織中Wnt信號通路、干細胞相關生物標志物、血管內皮生長因子、CD34的表達等均參與了血管再生，TSA預處理通過激活Wnt信號和上調干細胞相關標志物保護游離皮瓣缺氧損傷。

水蛭素可通過p38 MAPK/IKK/NF‐κB 信號通路影響術后血運障礙皮瓣中IL‐6、TNFα、ICAM‐1 的表達，ICAM‐1具有穩定細胞間作用和促進內皮細胞和白血球遷移的作用[29]，ICAM‐1表達過度增加，可導致白細胞與內皮細胞黏附的瀑布反應，造成白細胞聚集并釋放炎癥介質、組織溶解酶，使細胞損傷加重，TNF‐α在這一調節網絡中具有重要作用，Min 等[30]證實，被TNFα激活的細胞因子可作為炎性介質加強內皮與白細胞間的作用，上調內皮細胞表達ICAM‐1 與VCAM‐1，通過PLC、蛋白激酶C (PKC)、PI3K、ROS等產生級聯反應，還能使NF‐κB激活啟動內皮細胞的炎性反應，從而引起血管損傷。

氧化應激損傷內皮功能，內皮細胞細胞高表達粘附分子和整合素，內皮與中性粒細胞、單核細胞粘附加強，改變血液的有形成分促使形成血栓，PI3K‐Akt‐eNOS‐NO‐NF‐κB、PKC‐ERKs信 號傳導通路與此過程有關。細胞應激反應、內皮、血管緊張素Ⅱ可引起氧化應激反應刺激血管平滑肌細胞的增生、遷移、凋亡。缺血再灌注損傷的脂質過氧化作用、蛋白質氧化、炎癥因子與氧化還原蛋白的過表達，共同導致細胞內鈣超載、DNA斷裂、血栓形成、炎癥反應、細胞凋亡、血管重塑等，而這些因素將損傷血管平滑肌細胞及內皮細胞[31]。ARE 可編碼Ⅱ型相解毒酶和抗氧化蛋白，而Nrf2可調控多種ARE抗氧化蛋白的表達，在ROS損傷內皮細胞過程起著至關重要的作用，Nrf2/ARE通路作用其靶基因醌氧化還原酶1（NQ‐01）、抗氧化酶血紅素加氧酶1（HO‐1）、谷胱甘肽-S-轉移酶（GST）和硫氧還蛋白（TRX）等保護血管[32]，改善微循環從而減輕皮瓣IR損傷。

5 鈣超載相關信號通路

皮瓣組織在長時間缺血再灌注后可產生大量ROS，ROS產生主要部位是線粒體呼吸鏈，同時線粒體也易受ROS攻擊而損傷，大量的ROS干擾核酸復制、呼吸鏈酶復合物和氧化線粒體蛋白質，使其催化及降解功能喪失；線粒體膜通透性轉換孔(MPTP)受ROS誘導而開放，導致線粒體發生腫脹、破裂及釋放細胞色素C，使其結構受到破壞，從而導致線粒體功能障礙，能量生成減少，鈣泵活性降低，Ca2+泵出減少，使細胞內Ca2+積聚；ROS作用于膜磷脂引起膜脂質過氧化，增加細胞膜對Ca2+的通透性，細胞外Ca2+大量進入細胞內，導致Ca2+濃度增高，一旦鈣超載發生，可刺激線粒體、肌質網耗能增加，導致細胞能量供應不足發生酸中毒，Na在細胞集聚激活Na/Ca2+交換系統，又使大量Ca2+進入細胞內，加重鈣超載。鈣超載可激活Ca2+依賴性中性蛋白酶，介導TNF信號轉導通路及調控P53，從而誘發細胞凋亡。目前認為鈣超載與細胞凋亡密切相關，細胞鈣超載可能是細胞發生凋亡的條件。

PI3K‐Akt信號轉導通路的激活可減少Bcl‐2 的下降和caspase‐3 的活化[33-34]，而作為細胞凋亡過程中起重要作用的Bcl‐2蛋白可阻斷線粒體上MPTP、減少細胞內鈣超載，抑制細胞凋亡[35-36]，Akt活化后可調控線粒體上的MPTP，促使細胞內Ca2+排出，降低細胞內鈣濃度。同時MPTP可調控白介素、細胞色素C、凋亡因子釋放，最終抑制細胞凋亡。

蛋白激酶C依賴Ca2+、DG和磷脂酰絲氨酸(PS)而激動,參與調節鈣穩態，細胞內PKC信號轉導途徑可被氧自由基、脂質過氧化產物激活，使細胞膜上L型鈣通道磷酸化激活Na/Ca2+和Na/H交換及增強鈣泵活力，從而維持細胞鈣穩態。細胞內鈣離子濃度的升高可激活細胞內鈣敏信號：PKC、MAPKs、鈣/鈣調素依賴性蛋白激酶（Ca2+/CaMK）和鈣調神經磷酸酶(CaN)等，此外細胞內Ca2+濃度升高可使Fos、Jun、Nru77等轉錄因子活性改變，啟動細胞凋亡。Ca2+螯合劑、鈣通道阻滯劑及鈣調素拮抗物均可減輕鈣超載，減輕細胞凋亡，減輕皮瓣IR。

綜上所述，皮瓣缺血再灌注損傷的保護可從其發生、發展的一系列病理生理過程所相關的信號轉導通路層面出發，尋求減輕或預防IR方法、措施，但IR是多種細胞信號通路相交叉、相影響的結果，與IR相關的信號通路中仍存有許多疑問，未來對IR相關細胞信號通路進一步深入地研究將成為了解IR發生發展過程，更好的預防和減輕皮瓣缺血再灌注損傷的關鍵。

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