土茯苓總黃酮抗單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎間質(zhì)纖維化研究

蔡月琴 陳方明 方明筍 朱科燕 王德軍

浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)研究中心/比較醫(yī)學(xué)研究所 杭州 310053

腎間質(zhì)纖維化（renal interstitial fibrosis，RIF）是各種不同病因的慢性腎臟疾病進(jìn)行性發(fā)展的共同途徑，是終末期腎衰竭的共同病理表現(xiàn)，其主要病理特點(diǎn)為腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞增生和細(xì)胞外基質(zhì)過度積聚[1-3]。目前臨床上對RIF的治療原則主要是針對基礎(chǔ)疾病的治療和減少導(dǎo)致腎功能惡化的因素，如合理降低血壓、改善血糖、調(diào)整血脂等，這些只能有限地緩解病情發(fā)展。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑（angiotensin converting enzyme inhibitors，ACEI）和血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑（angiotensinⅡ receptor antagonist，ARB）是近年來臨床應(yīng)用較為廣泛的藥物。在大鼠RIF模型中，研究已證實(shí)ARB厄貝沙坦能夠延緩RIF進(jìn)展[4-5]。其他抗腎纖維化的治療方法有抗轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transformation growth factor-β1，TGF-β1）抗體、環(huán)氧合酶抑制劑、秋水仙堿、中藥及基因治療等，但這些治療方法都因?yàn)榀熜Р淮_切或者副作用明顯，在臨床上應(yīng)用受到了限制[6]。因此，尋找更多的抗纖維化藥物是目前腎臟病學(xué)的主要任務(wù)之一。

土茯苓是百合科植物光葉菝葜（Smilax glabra Roxb.）的干燥根莖，為一常用中藥，首載于《本草綱目》，為清熱除濕解毒之要藥，在臨床廣泛應(yīng)用于慢性腎臟疾病的治療[7-8]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，土茯苓具有改善糖尿病腎病大鼠腎臟病理變化、保護(hù)腎臟的作用[9-11]。本研究采用單側(cè)輸尿管結(jié)扎（unilateral ureteral obstruction，UUO）的方式建立大鼠RIF模型，觀察從土茯苓提取物中分離純化的土茯苓總黃酮（smilax glabra flavonoids，SGF）對大鼠腎功能、腎組織病理形態(tài)和TGF-β1表達(dá)水平的影響，明確SGF對大鼠RIF的干預(yù)作用，為深入研究中醫(yī)藥防治RIF的藥理作用及相關(guān)機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級健康雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量160～180g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供[許可證號：SCXK（滬）2012-0002]。飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)研究中心屏障實(shí)驗(yàn)室 [許可證號：SYXK（浙）2013-0184]，溫度（22±2）℃，相對濕度 40%～60%。

1.2 藥品與試劑 SGF由浙江省中醫(yī)院制劑室提純并測定含量，以蒸餾水溶解后分別調(diào)整濃度為3mg·mL-1、6mg·mL-1和 12mg·mL-1備用。厄貝沙坦購于賽諾菲制藥有限公司（批號：2A336），以蒸餾水溶解稀釋至 2mg·mL-1備用。肌酐（creatinine，CREA）、尿素氮

（blood urea nitrogen，BUN）、白蛋白（albumin，ALB）、總蛋白（total protein，TP）檢測試劑盒購于南京建成生物科技公司（批號分別為171034/50001826、07128/00001355、022063/50002146、19018/00001413）；TGF-β1抗體購自 Abcam 公司 （批號：GR1900395）；Masson試劑盒購于南京貝索生物公司（批號：20151119）。

1.3 UUO大鼠模型建立及分組 大鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，剃毛刀去毛，75%乙醇消毒，選擇腹正中線稍偏左切口，依次切開皮膚至腹腔，游離腎臟及輸尿管，用組織鉗托起左側(cè)輸尿管中段部位，止血鉗夾閉，4-0絲線結(jié)扎左側(cè)輸尿管近腎盂段及遠(yuǎn)端，然后依次縫合皮膚，建立UUO大鼠模型。造模后所有大鼠均適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，依據(jù)體質(zhì)量分為對照組、模型組、SGF低劑量組、SGF中劑量組、SGF高劑量組及厄貝沙坦組，每組10只。對照組手術(shù)方式同模型組，打開腹腔后游離輸尿管但不結(jié)扎，即縫合皮膚。根據(jù)土茯苓的臨床常用劑量換算出其有效劑量，再依據(jù)土茯苓有效劑量和前期SGF的細(xì)胞毒性試驗(yàn)確定SGF的有效劑量。SGF低劑量組大鼠采用3mg·mL-1SGF灌胃，灌胃劑量為15mg/（kg·d）；中劑量組采用6mg·mL-1SGF灌胃，灌胃劑量為30mg/（kg·d）；高劑量組采用12mg·mL-1SGF灌胃，灌胃劑量為60mg/（kg·d）。厄貝沙坦組大鼠灌胃劑量為10mg/（kg·d）。對照組和模型組分別以等量無菌飲用水灌胃。各組灌胃1次/d，連續(xù)2周。給藥第2周末，將各組大鼠分別放入代謝籠，收集24h尿液并稱體重；麻醉后心臟采血，分離血清待用。處死各組大鼠，取腎臟稱重，并解剖左側(cè)腎臟，用于病理學(xué)觀察。

1.4 各組大鼠腎功能指標(biāo)檢測 全自動生化儀檢測各組大鼠血清 ALB、BUN和血清肌酐（serum creatinine，Scr）的含量，24h 尿蛋白（urine total protein，U-TP）、尿尿素氮（urine urea nitrogen，UUN）、CREA 的含量，并計(jì)算肌酐清除率（creatinine clearance rate，Ccr)。Ccr（mL·min-1）=CREA（μmol·L-1）×每min尿量（mL·min-1）/Scr（μmol·L-1）。

1.5 各組大鼠腎組織病理學(xué)檢查 將各組大鼠病變側(cè)腎臟置于10%中性甲醛溶液中固定1～2d，蒸餾水沖洗，脫水，透明，浸蠟后，常規(guī)石蠟包埋切片，經(jīng)二甲苯脫水，HE染色，200倍光學(xué)顯微鏡下觀察腎組織病理學(xué)改變。

1.6 Masson染色分析各組大鼠腎組織纖維化程度各組大鼠病變側(cè)腎組織石蠟切片脫蠟，蒸餾水沖洗，蘇木素染液染核2min，Masson麗春紅酸性復(fù)紅染液染色5min，1%苯胺藍(lán)染液染色5min，1%冰醋酸分化，二甲苯透明，200倍光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.7 免疫組化檢測各組大鼠腎組織TGF-β1蛋白表達(dá)水平 大鼠腎組織石蠟切片置于60℃烤箱烘烤2h，脫蠟，修復(fù)液高壓熱修復(fù)，3%H2O2溶液阻斷過氧化物酶，PBS溶液洗滌3次，滴加TGF-β1一抗，4℃孵育過夜，PBS溶液洗滌5次，滴加二抗，37℃孵育20 min，PBS溶液洗滌5次，二氨基聯(lián)苯胺顯色5min，蘇木素復(fù)染、透明后封片，采用Carl Zeiss Imaging Systems對每張切片所要分析的部位拍攝3張照片（200倍），應(yīng)用Image-proplus 6.0圖像分析軟件進(jìn)行圖像分析。TGF-β1陽性細(xì)胞經(jīng)DAB顯色呈棕黃色，計(jì)算陽性染色細(xì)胞的平均光密度表示TGF-β1蛋白相對表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料均以±s表示，組間比較應(yīng)用單因素方差分析（post hoc），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腎功能指標(biāo)的比較 模型組大鼠血清BUN、Scr含量均高于對照組，ALB含量低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。SGF中劑量組和SGF高劑量組大鼠血清BUN、Scr含量均低于模型組（P＜0.05或0.01），SGF低劑量組、厄貝沙坦組Scr含量低于模型組（P＜0.05）。模型組大鼠尿液中U-TP、UUN、CREA含量均高于對照組（P＜0.01），Ccr低于對照組（P＜0.05）；而SGF高劑量組、厄貝沙坦組大鼠尿液中U-TP、UUN、CREA 含量均顯著低于模型組（P＜0.05），SGF中劑量組U-TP、CREA含量均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1、2。

表1 各組大鼠血清中ALB、BUN、Scr含量（±s，n=10）Tab.1 The level of ALB,BUN and Scr in rat serum(±s,n=10)

表1 各組大鼠血清中ALB、BUN、Scr含量（±s，n=10）Tab.1 The level of ALB,BUN and Scr in rat serum(±s,n=10)

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。Note:Compared with control group,*P＜0.05,**P＜0.01;compared with model group,#P＜0.05,##P＜0.01.

組別ALB（g·L-1）BUN（mmol·L-1）Scr（μmol·L-1）對照組模型組SGF低劑量組SGF中劑量組SGF高劑量組厄貝沙坦組30.43±0.71 28.22±0.81**29.02±1.41 28.43±1.53 28.67±1.19 29.02±1.16 5.05±0.57 8.26±0.95**7.90±0.96 7.27±0.81#7.26±0.64#8.54±1.27 57.18±4.45 72.00±11.52**63.11±4.09#61.35±3.66#59.69±2.76##60.88±4.80#

表2 各組大鼠尿液中U-TP、UUN、CREA和 Ccr含量（±s，n=10）Tab.2 The level of U-TP,UUN,CREA and Ccr in rat urine(±s，n=10)

表2 各組大鼠尿液中U-TP、UUN、CREA和 Ccr含量（±s，n=10）Tab.2 The level of U-TP,UUN,CREA and Ccr in rat urine(±s，n=10)

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05。Note:Compared with control group,*P＜0.05,**P＜0.01;compared with model group,#P＜0.05.

組別U-TP（mg·L-1）UUN（mmol·L-1）CREA（μmol·L-1）Ccr（mL·min-1）對照組模型組SGF低劑量組SGF中劑量組SGF高劑量組厄貝沙坦組768.50±134.96 1 060.90±247.87**892.58±202.22 841.75±154.80#837.83±146.26#850.82±152.14#282.84±40.91 422.08±131.04**349.63±73.79 348.86±75.62 318.61±69.81#301.65±67.16#2 586.29±586.68 3 585.30±835.47**3 005.00±625.34 2 825.25±501.42#2 788.50±451.47#2 729.45±531.62#1.02±0.16 0.83±0.12*0.79±0.16 0.85±0.15 0.93±0.18 0.91±0.14

2.2 各組大鼠腎組織病理形態(tài)的比較 對照組大鼠腎臟大小形態(tài)正常，顏色暗紅，表面光滑，彈性好；模型組大鼠腎臟呈略帶白色的灰紅色，腎盂嚴(yán)重積水，腎實(shí)質(zhì)萎縮變薄，光鏡下觀察可見多數(shù)的腎小管基底膜出現(xiàn)不規(guī)則改變，完整性喪失；SGF各劑量組和厄貝沙坦組大鼠腎臟在腫脹程度、腎實(shí)質(zhì)萎縮、腎小管毀損等方面較模型組均有不同程度地改善。見圖1。

圖1 各組大鼠腎組織病理形態(tài)的比較（HE染色，200×）Fig.1 Comparison of pathological morphology of renal tissue in each group(HE stain,200×)

2.3 各組大鼠腎組織纖維化情況的比較 Masson染色光鏡下觀察可見，對照組大鼠腎小管結(jié)構(gòu)正常，腎小管上皮細(xì)胞排列整齊，腎小管間質(zhì)無纖維化，無炎細(xì)胞浸潤，模型組大鼠腎小管上皮細(xì)胞常見重度空泡和顆粒變性，細(xì)胞扁平，管腔擴(kuò)張，大量炎細(xì)胞浸潤，大量膠原纖維形成，腎間質(zhì)重度纖維化；SGF各劑量組、厄貝沙坦組大鼠在炎細(xì)胞浸潤、纖維組織增生、腎間質(zhì)纖維化等方面較模型組均有不同程度改善。見圖2。

2.4 各組大鼠腎組織TGF-β1蛋白表達(dá)水平的比較

圖2 各組大鼠腎組織纖維化情況的比較（Masson染色，200×）Fig.2Comparison ofrenal fibrosis in each group(Masson stain,200×)

TGF-β1蛋白在對照組大鼠的腎小管上皮細(xì)胞中無明顯陽性表達(dá)；模型組大鼠的腎小管上皮細(xì)胞TGF-β1蛋白相對表達(dá)量高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；SGF 中、高劑量組、厄貝沙坦組大鼠腎小管上皮細(xì)胞中棕黃色顆粒均減少，TGF-β1蛋白相對表達(dá)量低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或 0.01）。見圖3、表3。

圖3 各組大鼠腎組織TGF-β1表達(dá)水平的比較（免疫組化，200×）Fig.3Comparison ofTGF-β1expression in renal tissue in each group(immunohistochemical,200×)

表3 各組大鼠腎組織TGF-β1蛋白表達(dá)水平的比較（±s，n=30）Tab.3 Comparison of TGF-β1expression in renal tissue in each group(±s,n=30)

表3 各組大鼠腎組織TGF-β1蛋白表達(dá)水平的比較（±s，n=30）Tab.3 Comparison of TGF-β1expression in renal tissue in each group(±s,n=30)

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。Note:Compared with control group,*P＜0.05，**P＜0.01;compared with model group,#P＜0.05,##P＜0.01

組別平均光密度對照組模型組SGF低劑量組SGF中劑量組SGF高劑量組厄貝沙坦組0.0967±0.0186 0.1168±0.0165**0.1074±0.0120 0.1047±0.0097#0.1020±0.0094##0.1016±0.0127##

3 討論

腎組織損傷后，損傷部位的細(xì)胞趨化因子會形成濃度梯度，為炎性細(xì)胞提供一個(gè)趨化信號，促使其向受損組織區(qū)域浸潤，從而引起炎癥的發(fā)生[12-13]。繼而腎間質(zhì)內(nèi)巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞發(fā)生浸潤，這些改變導(dǎo)致腎小管萎縮，腎實(shí)質(zhì)被纖維組織取代，最終發(fā)生RIF[14]。結(jié)扎單側(cè)輸尿管導(dǎo)致輸尿管梗阻，是經(jīng)典的RIF動物模型的建立方式。本實(shí)驗(yàn)建立了大鼠RIF模型，生化檢測提示UUO模型組大鼠血清BUN、Scr以及尿液中U-TP、UUN、CREA等含量均顯著高于對照組，血清ALB含量則顯著低于對照組，提示UUO大鼠的腎功能受損；腎組織HE染色和Masson染色鏡下觀察可見腎間質(zhì)內(nèi)大量單核細(xì)胞浸潤，成纖維細(xì)胞聚集，腎小管結(jié)構(gòu)嚴(yán)重毀損，管腔塌陷，大量炎細(xì)胞浸潤，并出現(xiàn)較多的膠原纖維，提示梗阻腎發(fā)生廣泛的腎小管上皮細(xì)胞壞死，腎間質(zhì)廣泛纖維化；免疫組化檢測顯示UUO大鼠腎小管上皮細(xì)胞中大量棕黃色顆粒表達(dá)，平均光密度高于對照組，表明TGF-β1蛋白表達(dá)水平上調(diào)。以上結(jié)果均證實(shí)大鼠RIF模型建立成功。

作為臨床上常用的ARB，厄貝沙坦治療RIF作用明確，在一定程度上能夠延緩腎纖維化的進(jìn)程[5]。筆者團(tuán)隊(duì)的前期研究中已證實(shí)土茯苓具有改善糖尿病腎病大鼠腎臟病理變化、保護(hù)腎臟的作用[9-11]，繼而通過大孔樹脂技術(shù)從土茯苓提取物中分離純化得到SGF。本研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用SGF和厄貝沙坦干預(yù)后，UUO大鼠血清中BUN、Scr以及尿液中U-TP、UUN、CREA的含量降低，表明SGF和厄貝沙坦均能改善UUO大鼠的腎功能指標(biāo)。而且SGF各劑量組、厄貝沙坦組大鼠腎臟在腎實(shí)質(zhì)萎縮、腎小管結(jié)構(gòu)毀損、炎細(xì)胞浸潤、纖維組織增生等方面較模型組均有不同程度地減輕，提示大鼠RIF得到明顯改善。

既往研究證實(shí)，病理狀態(tài)下TGF-β1是目前已知最強(qiáng)的促纖維化細(xì)胞因子，參與了RIF進(jìn)程中所有的關(guān)鍵步驟[15-16]。本研究中以免疫組化檢測了腎組織TGF-β1蛋白表達(dá)，結(jié)果提示SGF和厄貝沙坦能不同程度地抑制TGF-β1蛋白表達(dá)。推測SGF能阻斷TGF-β1介導(dǎo)的腎損傷和纖維化過程，提示SGF改善RIF的作用可能通過下調(diào)TGF-β1表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。

綜上所述，SGF可明顯改善UUO大鼠的腎功能，減輕腎臟病變，降低腎組織TGF-β1蛋白的表達(dá)，從而延緩腎小管損傷和纖維組織的增生。本研究為開發(fā)有效的抗RIF治療藥物提供了一定的理論依據(jù)。

[1] Takaori K,Nakamura J,Yamamoto S,et al.Severity and frequency ofproximaltubule injury determinesrenal prognosis[J].J Am Soc Nephrol,2016,27(8):2393-2406.

[2] Lu J,Shi J,Li M,et al.Activation of AMPK by metformin inhibits TGF-β-induced collagen production in mouse renal fibroblasts[J].Life Sci,2015,127:59-65.

[3] Yan Y,Ma L,Zhou X,et al.Src inhibition blocks renal interstitial fibroblast activation and ameliorates renal fibrosis[J].Kidney Int,2016,89(1):68-81.

[4] Tang L,Yi R,Yang B,et al.Valsartan inhibited HIF-1α pathway and attenuated renal interstitial fibrosis in streptozotocin-diabetic rats[J].Diabetes Res Clin Pract,2012,97(1):125-131.

[5] 孫時(shí)華,嚴(yán)富華,姜建軍,等.紅花黃色素對單側(cè)輸尿管梗阻大鼠模型腎間質(zhì)纖維化的影響[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2010,28(4):891-893.SUN Shihua,YAN Fuhua,JIANG Jianjun,et al.Effect of safflor yellow injection on the renal interstitial fibrosis in unilateral ureteral obstructoin rats[J].Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine,2010,28(4):891-893.

[6] Liu L,LiF G,Yang M,etal.Effectofproinflammatory interleukin-17A on epithelial cell phenotype inversion in HK-2 cells in vitro[J].Eur Cytokine Netw,2016,27(2):27-33.

[7] 張秋林.尿毒清膠囊對慢性腎功能衰竭患者腎纖維化指標(biāo)的影響[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2007,24(2):108-112.ZHANG Qiulin.Effect of niaoduqing capsule on kidney fibrosis parameters in chronic renal failure[J].Journal of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine,2007,24(2):108-112.

[8] 趙洪軍，楊興，胡沙沙.腎通丸對慢性腎臟病患者腎臟纖維化進(jìn)程影響研究[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2014,16(1):11-14.ZHAO Hongjun,YANG Xing,HU Shasha.Clinical study on effect of shentong pillon on renal fibrosis of patients with chronic kidney disease[J].Journal of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,2014,16(1):11-14.

[9] 王德軍,壽旗揚(yáng),周為民,等.土茯苓對糖尿病腎病大鼠糖代謝及腎功能的影響[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2009,27(12):2262-2264.WANG Dejun,SHOU Qiyang,ZHOU Weimin,etal.Effect of Rhizoma Smilacis Glabrae on glucose metabolism and renal function in diabetic nephropathy rats[J].Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine,2009,27(12):2262-2264.

[10]王德軍,壽旗揚(yáng),陳方明,等.土茯苓對糖尿病腎病大鼠腎組織形態(tài)學(xué)及相關(guān)因子ET、NO、TGF-β1的影響[J].中國中醫(yī)藥科技,2010,17(4):320-322.WANG Dejun,SHOU Qiyang,CHEN Fangming,et al.Effect of Smilax glabra on morphology and related factors ET,NO and TGF-beta 1 in renal tissue of diabetic nephropathy rats[J].Journal of Chinese Medicine Science and Technology,2010,17(4):320-322.

[11]張利棕,壽旗揚(yáng),王德軍,等.土茯苓對腎性高血壓大鼠血液流變學(xué)和氧化應(yīng)激的影響[J].浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2012,36(7):803-808.ZHANG Lizong,SHOU Qiyang,WANG Dejun,etal.Effects of Smilax Glabra on hemorheology and oxidative stress in renovascular hypertensive rats[J].Journal of Zhejiang Chinese Medical University,2012,36(7):803-808.

[12]Cheng X,Zheng X,Song Y,et al.Apocynin attenuates renal fibrosis via inhibition of NOXs-ROS-ERK-myofibroblast accumulation in UUO rats[J].Free Radic Res,2016,50(8):840-852.

[13]Kim T W,Kim Y J,Seo C S,et al.Elsholtzia ciliata(Thunb.)Hylander attenuates renalinflammation and interstitial fibrosis via regulation of TGF-βand Smad3 expression on unilateral ureteral obstruction rat model[J].Phytomedicine,2016,23(4):331-339.

[14]Chen X,Wei S Y,Li J S,et al.Overexpression of heme oxygenase-1 prevents renal interstitial inflammation and fibrosis induced by unilateral ureter obstruction[J].PLoS One,2016,11(1):e0147084.

[15]Li L,Qi L,Liang Z,et al.Transforming growth factorβ1 inducesEMT by the transactivation ofepidermal growth factor signaling through HA/CD44 in lung and breast cancer cells[J].Int J Mol Med,2015,36(1):113-122.

[16]Du J,Hong S,Dong L,et al.Dynamic sialylation in transforming growth factor-β(TGF-β)-induced epithelial to mesenchymal transition[J].J Biol Chem,2015,290(19):12000-12013.