U87細胞分泌外囊泡中HOTAIR刺激膠質瘤血管新生的機制研究

馬鑫 濮劍辰 李婷 許穎 范春雷 田男

浙江中醫藥大學生命科學學院 杭州 310053

人腦膠質瘤（glioblastoma）是中樞神經系統最常見的原發性惡性腫瘤。因其與正常腦組織沒有明確界限，使用傳統手術方法難以達到根除目的，同時由于血腦屏障的存在，化療等治療手段難以奏效，患者5年生存率不足5%[1-4]。目前腦膠質瘤的發病機制尚不清楚，但越來越多的研究表明，血管化是實體腫瘤發展進程中的重要組成部分，腫瘤新生血管為實體腫瘤提供生長所需的營養和氧氣，同時清除腫瘤細胞的代謝廢物，促進腫瘤細胞遠端轉移[5-9]。因此探索腫瘤血管生成的調控分子可為膠質瘤治療提供新方向。

近年來，關于細胞外囊泡（extracellular vesicles,EVs）與腫瘤關系的研究已成為當前研究的一大熱門。腫瘤細胞分泌的EVs能夠傳遞信息到其它腫瘤細胞以及正常基質細胞，營造適合腫瘤生長的微環境，促進血管生成、腫瘤生長發展以及遠端轉移[10-12]。Giusti等[13]發現人腦膠質瘤細胞分泌的EVs在血管內皮細胞增殖、遷移以及成管的過程中有重要作用。研究還發現長鏈非編碼RNAs（long non-coding RNAs,lncRNAs）在膠質瘤血管新生中扮演重要角色[14-15]。Rinn課題組發現了 HOX轉錄反義 RNA（HOX transcript antisense intergenic RNA,HOTAIR），其表達與膠質瘤的級別和預后生存均密切相關，是獨立于病理診斷指標之外的膠質瘤患者預后指標[16-17]。眾多研究證實，HOTAIR在膠質瘤細胞中的高表達，與膠質瘤細胞增殖、細胞周期、細胞凋亡、糖酵解和線粒體功能密切相關[16,18-20]，但HOTAIR在膠質瘤血管新生中的作用，以及HOTAIR與EVs的關系至今不明。因此，本研究通過沉默膠質瘤細胞中的HOTAIR基因，觀察其對人腦微血管內皮細胞（human brain microvascular endothelial cells,HBMVEC）增殖、遷移和血管形成能力的影響，同時進一步研究膠質瘤細胞中HOTAIR與EVs的關系，探討HOTAIR參與膠質瘤血管新生的可能機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞與主要試劑 人腦膠質瘤細胞U87和HBMVEC均購自中科院上海細胞所。DMEM高糖培養液、無支原體胎牛血清和含0.25%EDTA胰酶均購于杭州昊天生物技術有限公司（批號：2016122902、20160712、20161019）；噻唑藍（methylthiazolyldiphenyltetrazolium bromide，MTT）購于杭州昊天生物技術有限公司（批號：3068B512）；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購于美國 Sigma公司（批號：67-68-5）；姬姆薩染液（Giemsa stain）購自上海源葉生物科技有限公司（批號：L16F8G29355）。Trizol購于美國Invitrogen公司（批號：127706）；游離RNA提取試劑盒RNApure Circulating Reagent Kit購于北京康為世紀生物科技有限公司（批號：01731/60138）；HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒購于北京康為世紀生物科技有限公司（批號：40129）；Ultra SYBR熒光定量試劑盒購于北京康為世紀生物科技有限公司（批號：40140）。Lipofectamine2000 Reagent購于美國 Invitrogen公司（批號：1704478），Triton X-100購于美國Sigma公司（批號：92046-34-9），引物由上海生工生物工程有限公司設計合成，過表達質粒LZRSHOTAIR購自美國addgene公司。

1.1.2 儀器 恒溫恒濕培養箱為美國Thermo公司產品；熒光定量PCR儀為美國Applied Biosystems公司產品；多功能酶標儀購于美國Molecular Devices公司；倒置光學顯微鏡及成像系統為日本Nikon公司產品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 U87細胞和HBMVEC均采用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養液，置于37°C、5%細胞CO2飽和濕度培養箱內培養，取對數生長期細胞進行實驗。

1.2.2 U87細胞培養上清液的收集 將U87細胞傳代后接種于6孔板，培養于37°C、5%CO2飽和濕度培養箱內，24h后觀察細胞生長狀態，將原細胞培養液吸出至離心管中，4°C、5 000r/min離心20min，離心后取上清液，分裝后-80°C保存。

1.2.3 脂質體法轉染U87細胞 U87細胞傳代培養至生長密度為30%～50%時用于轉染。將細胞分為4組：無意義RNA對照組（siGFP組）、siRNA陰性對照組（si-NC組）、siHOTAIR組、回復組（Rescue組）。轉染按照說明書方法進行，回復組采用HOTAIR siRNA與過表達質粒LZRS-HOTAIR共轉染（按3:5比例混合）。U87細胞轉染后，繼續置于 37°C、5%CO2飽和濕度培養箱內培養24h。轉染24h后收集細胞，于4℃、5 000r/min離心20min，離心后取上清液，分裝后-80℃保存。

1.2.4 U87細胞培養上清液處理和RNA提取 取轉染前U87細胞培養上清液4mL，分為空白組、RNase組、Triton X-100組、RNase和Triton X-100聯合組。空白組不作處理，RNase組加入2mg·mL-1RNase 1mL，Triton X-100組加入 0.1%Triton X-100 1mL，RNase和Triton X-100聯合組則分別加入2mg·mL-1RNase和0.1%Triton X-100各1mL，孵育20min。根據試劑盒說明書提取上清液中的RNA，5 000r/min離心10min，除去死細胞，將上清液轉移至新的離心管中，加入3倍體積的游離RNA提取試劑。震蕩30s使之充分混勻。將處理后的樣品在室溫放置5min，使蛋白核酸復合物完全分離。加入800μL氯仿，蓋好管蓋，劇烈震蕩 15s，室溫放置 2～3min。4°C、12 000r/min離心20min，此時樣品分成紅色有機相、中間層和上層無色水相3層。因RNA主要在水相中，故把水相轉移到新的無RNase的離心管中，在得到的水相溶液中加入等體積異丙醇，顛倒混勻，室溫放置30min。4°C、12 000r/min離心20min，棄去上清液。加入75%乙醇（用無RNase的水配制）洗滌沉淀，1mL游離RNA提取試劑加入1mL 75%乙醇。4°C、12 000r/min離心3min，小心棄去上清液，注意不要棄去RNA沉淀。室溫放置 2～3min，晾干。加入 30～100μL 無 RNase水充分溶解RNA，-80°C保存，防止降解。

1.2.5 熒光定量PCR檢測各組U87細胞培養上清液中HOTAIR基因含量 取轉染24h后的U87細胞，用Trizol試劑提取總RNA后，根據HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒說明書，逆轉錄合成cDNA。熒光定量PCR擴增，內參基因及目的基因引物序列見表1。擴增條件：95°C 預變性 10min，95°C 變性 15s、60°C退火1min，72°C延伸30s，擴增40個循環。采用比較CT值的方法計算樣本中mRNA的表達水平。Ratio=2-△△Ct，△Ct=目的基因 CT 值-內參基因 CT 值，△△Ct=△Ct實驗組-△Ct對照組。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.2.6 MTT法和克隆形成實驗檢測細胞HBMVEC增殖情況

1.2.6.1 MTT法檢測轉染后U87細胞上清液對HBMVEC增殖的影響 用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養液懸浮HBMVEC，然后將HBMVEC以3×103個/孔的密度接種于96孔板，每孔總體積為100μL。設置siGFP組、si-NC組、siHOTAIR組和回復組，每組6個復孔。培養4～6h后將原培養液分別替換為siGFP組、si-NC組、siHOTAIR組和回復組轉染后的U87細胞上清液，再次孵育。孵育6h、12h和24h后，每孔加入20μL濃度為5mg·mL-1的MTT，避光孵育4 h后棄培養液，每孔加入150μL DMSO，置于水平搖床震蕩混勻15min。將酶標儀的吸收波長設定為490 nm，測定每孔的OD值。細胞增殖率=實驗組OD值/對照組OD值×100%。

1.2.6.2 平板克隆形成實驗 取對數生長期的HBMVEC制成單細胞懸液，以5×102個/孔的密度接種于6孔板，設置si-NC組和siHOTAIR組，置于37°C、5%CO2飽和濕度培養箱內培養，12h后將培養液分別替換為轉染后si-NC組和siHOTAIR組的U87細胞上清液，2～3d換液1次。14d后棄去培養液，PBS沖洗3次，4%多聚甲醛固定30min，再以Giemsa染液染色15min。緩慢沖洗掉染液后鏡下觀察拍照并計數細胞克隆數。

1.2.7 Transwell細胞遷移實驗 將轉染24h后的U87細胞接種于含600μL無血清培養液的Transwell小室的下層，含100μL無血清培養液的HBMVEC懸液置于小室的上層，于37°C、5%CO2飽和濕度培養箱內孵育12h。取出小室，用4%多聚甲醛室溫固定小室底部聚碳酸酯微孔膜上的細胞30min，Giemsa染液染色15min。緩慢沖洗掉染液，棄掉上室未固定的細胞。光學顯微鏡下觀察、拍照，計數每個小室特定視野下穿過聚碳酸酯微孔膜底部的細胞數，進行組間比較。

1.2.8 HBMVEC體外成管實驗 將基質膠置于4℃條件下凍融過夜。設置陰性對照組和實驗組，在預冷的 96孔板中每孔加入 75μL基質膠，37°C放置60min。將HBMVEC懸液以2.5×104個/孔的密度加入96孔板對應孔中，待細胞貼壁后，將培養液替換為轉染后的U87細胞上清液繼續孵育。4～6h后，鏡下選取合適視野進行觀察拍照。

1.3 統計學方法 應用SPSS 20.0統計軟件進行統計學處理。計量資料以±s表示，常規進行方差齊性檢驗，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 沉默HOTAIR基因對HBMVEC增殖的影響熒光定量PCR結果顯示，siHOTAIR組U87細胞的HOTAIR表達水平明顯低于si-NC組，差異有統計學意義（P<0.05），回復組HOTAIR表達水平明顯高于siHOTAIR組，差異有統計學意義（P<0.01），見圖1A。MTT染色結果顯示，用轉染后U87細胞培養上清液孵育HBMVEC后，與si-NC組比較，siHOTAIR組細胞上清液孵育的HBMVEC增殖活力降低，差異有統計學意義（P<0.01），而與siHOTAIR組相比，回復組孵育的HBMVEC增殖活力顯著增加，差異有統計學意義（P<0.01），見圖1B。提示HOTAIR能夠特異性調控HBMVEC增殖。進一步的克隆形成實驗結果顯示，siHOTAIR組HBMVEC形成克隆數量少于si-NC組，差異有統計學意義（P<0.01），見圖1C和1D。

2.2 沉默HOTAIR基因對HBMVEC遷移的影響細胞遷移實驗結果提示，siHOTAIR組U87細胞誘導的HBMVEC遷移數量少于si-NC組，差異有統計學意義（P<0.01）。見圖2A和2B。

圖1 沉默HOTAIR基因對HBMVEC增殖的影響Fig.1 The influence of knockdown HOTAIR gene on HBMVEC proliferation

2.3 沉默HOTAIR基因對HBMVEC細胞成管的影響 實驗結果顯示，siHOTAIR組U87細胞誘導的HBMVEC細胞成管數量明顯少于si-NC組，差異有統計學意義（P<0.01）。見圖3A和3B。

2.4 HOTAIR基因與U87細胞分泌EVs的關系 熒光定量PCR結果顯示，空白組、RNase組、Triton X-100組3組間HOTAIR基因表達量無明顯差異（P>0.05），而RNase和Triton X-100聯合組 HOTAIR基因表達量則顯著低于其余3組，差異有統計學意義（P<0.01）。見圖4。

圖2 siHOTAIR轉染上清液對HBMVEC遷移的影響Fig.2 The influence of transfect supernatant on migration of HBMVEC

圖3 HBMVEC成管圖片（200×）Fig.3 The tubes formation of HBMVEC maps(200×)

圖4 U87細胞分泌的EVs中HOTAIR表達水平Fig.4 The expression levels of HOTAIR in extracellular vesicles derived by U87 cells

3 討論

lncRNAs是一類轉錄長度大于200nts、不編碼蛋白質的RNA分子，可在轉錄以及轉錄后水平調控調節相關基因表達，參與多種生物學活動[21-24]。越來越多的研究表明，lncRNAs與腫瘤之間存在密切關系，在腫瘤發生、腫瘤血管生成以及腫瘤遠端轉移等發展進程中扮演重要角色[25-29]。腫瘤血管生成與腫瘤生長密切相關，實體腫瘤的生長和轉移過程高度依賴腫瘤新生血管[30]。Jia等[31]研究證實，H19可通過抑制miRNA-29a從而促進膠質瘤血管生成和膠質瘤相關內皮細胞的生物學行為。Zhu等[32]研究發現肝癌高表達轉錄（highly up-regulated in liver cancer,HULC）基因通過磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B,PKB）/雷帕霉素靶向基因（mammalian target of rapamycin,mTOR）信號通路調節內皮細胞特異性分子-1（endothelial cell specific molecule-1,ESM-1）表達，從而參與膠質瘤血管生成。但HOTAIR在膠質瘤血管生成中的作用及其可能的分子機制尚未見于報道。本研究通過RNA干擾試驗發現沉默U87細胞中HOTAIR基因表達對HBMVEC增殖存在抑制作用，同時設立回復組以排除RNAi中的脫靶效應，反向驗證HOTAIR基因表達對HBMVEC增殖的影響。克隆形成、細胞遷移和體外成管實驗也證實HOTAIR在U87細胞誘導HBMVEC增殖、遷移以及成管過程中具有調控作用，進一步提示HOTAIR參與了膠質瘤血管新生過程。

大量研究表明，EVs在腫瘤血管生成過程中發揮重要作用，腫瘤細胞通過向細胞外分泌大量EVs進行細胞間信息交流，并創建適合腫瘤生長和轉移的微環境[33]。Gezer等[34]研究發現，在人宮頸癌細胞和乳腺癌細胞分泌的EVs中富含HOTAIR、長鏈非編碼RNA-p21（long non-coding RNA-p21，lncRNA-p21）、長鏈非編碼RNA-細胞周期蛋白D1（long non-coding RNA-cyclind1，lncRNA-CCND1）等 RNA 分子。越來越多的研究表明，腦膠質瘤細胞可以分泌大量EVs促進腫瘤生長及發展[35-37]。為了探索HOTAIR是否存在于U87細胞培養上清液中的EVs中，本研究首先通過熒光定量PCR證實在U87細胞上清液中存在HOTAIR分子，其次用去污劑Triton X-100和RNase證實細胞上清液中的HOTAIR分子受膜性囊泡保護。結合以上實驗結果，筆者推測沉默HOTAIR基因可以抑制U87細胞促血管生成活性，而HOTAIR分子可能存在于U87細胞分泌的EVs中，參與調控膠質瘤血管生成。

綜上所述，腫瘤新生血管是腫瘤細胞生長和轉移過程中不可或缺的重要組成部分，沉默HOTAIR基因可以抑制HBMVEC增殖、遷移以及成管能力。在后續研究中，筆者將從膠質瘤細胞培養上清液和患者血漿中分離EVs，并鑒定與HOTAIR相關的EVs的類型，進一步研究HOTAIR在膠質瘤血管生成中的作用及其可能的機制。

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