脂肪組織長期儲存的研究進展

張佩祺 綜述 周雙白 李青峰 審校

【提要】 自吸脂術出現以來，使用脂肪組織進行軟組織填充已成為臨床常見的治療方法。但目前臨床仍存在一處填充需要多次移植的情況。如能一次抽吸后對脂肪進行妥善保存，并在需要時進行再次注射，就可以減少抽脂次數，減輕患者痛苦。因此，對脂肪組織進行長期儲存并減少其重吸收率具有重要的臨床意義。本文就脂肪組織長期儲存的研究進展進行綜述。

自體脂肪移植填充是目前臨床常用的軟組織填充方法。脂肪組織具有來源豐富、操作簡單、無排異反應等優點，可用于瘢痕填充、創傷引起的面部萎縮[1]、Romberg病[2]、皺紋及乳房填充[3]等方面，是美容或修復領域的常用技術。

但脂肪移植存在重吸收問題，留存率僅30%～60%[4]。即使在細胞輔助移植等技術的幫助下，可提高脂肪留存效率，但目前大部分情況下仍需要多次進行脂肪移植，以達到精確的修復效果[5]。如能長期保存抽取的脂肪，可減少脂肪抽吸次數，減輕患者痛苦，并提高治療效率。因此，脂肪的長期儲存成為了脂肪移植治療中的重要課題。本文將從冷凍溫度、保存方式及冷凍保護劑使用等方面，對現有的脂肪組織保存方法的研究進展進行綜述。

1 脂肪組織與細胞保存的不同及難點

目前，細胞凍存技術已經比較成熟，一般多為加入凍存保護劑后進行程序降溫或玻璃化降溫。在保存細胞時，由于細胞多為分散的單個細胞或幾個細胞聚集的小團塊，因而在添加冷凍保護劑后可以與保護劑充分混勻，達到較好的保護效果。且細胞保存僅涉及單一細胞的保存，在選擇凍存方法及凍存保護劑時均只需考慮該細胞的特性，因而選擇較固定且單一。

而保存脂肪組織的難度則大于保存細胞，主要因為①脂肪組織為顆粒或團塊，在與冷凍保護劑混合時難以使保護劑完全滲透入組織團塊內部，導致顆粒中心部分的細胞或組織難以得到充分保護，凍存后的細胞活性也會因此受到較大影響；②組織保存涉及多種細胞，目前的研究中，構成較復雜的組織的保存仍處于探索階段[6]。脂肪組織含有脂肪細胞、成纖維細胞、脂肪干細胞及血管組織，因而在保存液的選擇及凍存方法上仍未形成共識。

2 脂肪長期儲存的新進展

目前常用的脂肪組織凍存法為程序降溫法，復蘇則采用快速復溫法。流程如下：①將脂肪組織進行低速離心，分離上層油脂及下層腫脹液；②將脂肪組織與凍存保護劑混合后分裝入冷凍管中；③將冷凍管置于梯度凍存盒，以每分鐘降溫10℃的速率[7]進行降溫，待降至-80℃后移至液氮中進行長期保存；④復蘇時將冷凍組織取出后直接置于37℃水浴中進行快速復蘇。

該方法主要參照細胞保存的方式，在保存脂肪組織時仍存在問題。快速冷凍法及等溫玻璃化法也被應用于組織保存，但其效果仍未明確。

2.1 溫度對脂肪保存的影響

細胞和組織長期體外保存最主要的手段為低溫冷凍保存，冷凍保存生物樣本對于細胞及細胞內酶的活性維持均有較好作用。保存溫度從4℃至-196℃（液氮）之間均有使用。在脂肪組織保存上，對于溫度的不同選擇是否會影響脂肪細胞活性及移植后重吸收率仍無定論。

一般認為，凍存溫度越低組織活性保留越好。但Shoshani等[8]將脂肪組織于-18℃中凍存2周后注射至裸鼠皮下，發現脂肪細胞活性與成活率接近新鮮脂肪組織。Moscatello等[9]將脂肪組織分別儲存于-20℃及液氮中，液氮組的脂肪細胞活性及ADSC活性均高于-20℃組。Wolter等[10]發現，于-80℃中凍存的脂肪組織，其脂肪細胞活性高于在-20℃中凍存的脂肪組織，且移植后成活率更高；如有冷凍保護劑存在，則成活比例更高。Atik等[11]將脂肪組織分別冷凍于-35℃與液氮中6個月，前者明顯出現脂肪細胞數量減少、脂肪空泡及纖維變性等問題，后者保存效果較好。

但是，與上述結果不同，MacRae等[12]將脂肪組織分別冷凍于-20℃及液氮中，未見兩組細胞活性有明顯差異。Li等[13]將脂肪組織加入羥乙基淀粉后，分別凍存于-20℃、-80℃和-196℃中，脂肪細胞活性均無明顯差異。Erdim等[14]在4℃下存儲脂肪細胞2周，其活性大于-20℃或-80℃冷凍條件下的脂肪細胞，雖相比新鮮脂肪組織活性略有下降，但無統計學差異。Lidagoster等[15]也得出與此相近的結論并指出，相較于1℃保存的脂肪組織，-16℃保存下的組織會有更明顯的炎癥反應和組織壞死，不利于脂肪移植后的存活。由于液氮保存大量脂肪組織的高成本限制了其臨床應用，以上結果提供了可使用商業型冰箱儲存脂肪組織的證據，降低成本的同時也增加了低溫冷凍法長期保存脂肪組織在臨床上應用的可行性。

值得注意的是，以上研究均存在一個共同的問題，組織保存和移植后觀察時間均較短，溫度對長期保存脂肪的活性和移植后效率的影響仍需進一步研究。

2.2 凍存方式對脂肪保存的影響

現階段常用的凍存方式主要分為慢速凍存法（程序凍存法）和快速凍存法（玻璃化凍存法）。

慢速凍存法作為傳統的凍存方法在細胞和組織儲存上已經使用多年，技術較為成熟。常用的步驟為將脂肪組織進行預處理后（通常添加冷凍保存劑），在12 h內以較慢速度降至-80℃，再移至液氮中進行儲存。慢速凍存法具有安全、降低組織損耗等特點，對復合組織的生物活性具有較好的保護作用[16]。Conti等[7]將新鮮脂肪組織以慢速冷凍法降溫后置入液氮中凍存，2周后于小鼠皮下進行脂肪移植，移植1周后MRI顯示脂肪吸收明顯，但人脂肪間充質干細胞（ADSC）的再生與分化能力未受明顯影響。Minonzio等[17]認為，慢速冷凍法凍存的ADSC分化能力和增殖能力無明顯異常。由于慢速冷凍法會在降溫過程中產生大量結晶，同時出現滲透壓的改變。冰晶會對細胞產生一定的機械損傷，而滲透壓會使細胞膜出現皺縮，影響細胞復溫后的性能。

快速凍存法也被稱為玻璃化凍存法，是將組織置于高濃度的凍存保護劑中，然后直接放入液氮中進行凍存[18]。脂肪組織的玻璃化凍存暫無明確的研究結果，但是其他組織，如胚胎[19]、精子[20]、卵母細胞[21]等，均有證據表明快速凍存法對組織和細胞活性的保存更好。玻璃化凍存雖然對組織活性的保存有效，且相比于慢速凍存法更節省時間和凍存空間，但高濃度的凍存保護劑帶來的細胞毒性問題仍不能忽略。

除以上兩種已較為常見的凍存方式外，近年來新興的一種方法為等溫玻璃化，即將樣品置于高濃度的糖、多元醇及有機聚合物中，在室溫下進行干燥處理。過程中不會結冰，但生化反應停止，樣本可以免受低溫損傷[22]。低溫會引起酶活性降低，活性氧的清除隨之減弱，導致脂肪發生過氧化反應，減少脂肪細胞的活性或引起脂肪組織的纖維化，影響脂肪移植效果[23-24]。這種新興的、無需冷凍的方法還需要更多的研究來證實其對脂肪組織的保存效果。

2.3 冷凍保護劑對脂肪組織保存的作用

冷凍保護劑是在低溫凍存過程中，保護細胞免受低溫后水分子結晶的破壞而添加的溶劑，一般分為滲透性和非滲透性兩種。前者多為小分子中性物質，弱化水結晶過程，減少對細胞結構和功能的破壞，包括甘油、DMSO、丙二醇等溶劑。非滲透性保護劑多為大分子，通過降低溶質濃度減少低溫冷凍對細胞造成的損傷，包括氨基酸、聚乙二醇、白蛋白、羥乙基淀粉等。

肖斌等[24]發現，脂肪組織在不同的凍存條件下，需不同的凍存保護劑才能達到較好的細胞保護效果。-80℃凍存時，添加15%DMSO的細胞活性較高；-196℃凍存時，添加15%DMSO＋6%丙二醇的細胞活性較高。仇侃敏等[25]的研究表明，相同凍存條件下，胎牛血清（FBS）+8%DMSO相比于無血清凍存液更有利于保持脂肪細胞活性，并明顯提高復溫后的存活率及移植后成活率。另有研究顯示，加入DMSO+海藻糖的脂肪組織凍存后，相對比于新鮮脂肪組織，成活脂肪細胞數量僅少量減少，而相比于未加入保護劑組，存活細胞數量明顯提高，且組織收縮率明顯減低；在動物實驗中，3組均出現組織重吸收現象，但加入凍存保護劑組明顯小于未加入組，且未加入保護劑的脂肪組織中出現大量纖維化組織，影響術后效果[26]。

但大多數保護劑均存在一定的細胞毒性，如15%的DMSO有利于保存脂肪組織活性及移植后成活率[27]，但具有細胞毒性作用，復溫后需經多次洗脫，才可進行移植，增加了手術成本。

非活體實驗中，在慢速凍存及快速復溫的條件下，海藻糖可單獨作為凍存保護劑應用于脂肪組織的低溫保存，因海藻糖無細胞毒性，洗脫時可減少步驟及耗時[28]。

3 總結與展望

脂肪保存在多年來的研究中已經有了一定的進展，但仍有很多問題需要解決。目前的研究中，大多數實驗都為離體的細胞學實驗或動物實驗，仍需更多臨床研究來提供更確切的研究數據。已有的研究結果表明，脂肪組織的保存可選擇較高的溫度；凍存保護劑的選擇上，無毒、無異種抗原、易洗脫是今后發展的方向；DMSO及FBS應被更安全的材料替代。