多發(fā)性骨髓瘤中Wilms瘤基因（WT1）基因異常甲基化的研究

李 靜，王立立，楊 濤，溫 麗，李曉紅，張倩倩，李 燕*

（1.河北省中醫(yī)院，河北 石家莊 050011；2.河北省人民醫(yī)院，河北 石家莊 050057；3.河北省兒童醫(yī)院，河北 石家莊 050030）

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是是常見(jiàn)的血液系統(tǒng)惡性疾病，以中老年患者居多。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，10%～15%AML患者存在WT1基因突變[1-2]。在探索多發(fā)性骨髓瘤患者中發(fā)病機(jī)制、異常免疫及靶向治療過(guò)程中，WT1的作用越來(lái)越受到重視，但其異常甲基化的狀態(tài)及其影響因素在MM中的作用目前仍不十分清楚，故本研究對(duì)MM中WT1甲基化及其表達(dá)進(jìn)行了研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年1月～2017年10月河北省中醫(yī)院收治的MM患者骨髓標(biāo)本60例，男32例，女28例，中位年齡68歲（52至79歲）。每例患者均行血常規(guī)、骨髓像分析、β-2微球蛋白、生化、免疫球蛋白、血尿免疫固定電泳、影像學(xué)檢查等，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照國(guó)內(nèi)診斷標(biāo)準(zhǔn)，按1975年Duriesalmon分期系統(tǒng)進(jìn)行分期，其中Ⅰ期15例，Ⅱ期20例，Ⅲ期25例。以同期就診的30例非惡性血液病患者（主要為缺鐵性貧血30例）為對(duì)照，缺鐵性貧血患者均經(jīng)詳細(xì)病史、血常規(guī)、貧血三項(xiàng)、血涂片等相關(guān)檢查確診。

1.2 研究方法

1.2.1 甲基化分析

使用人淋巴細(xì)胞分離液分離標(biāo)本單個(gè)核細(xì)胞，提取DNA，進(jìn)行PCR反應(yīng)，CpG甲基轉(zhuǎn)移酶修飾陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)本。

1.2.2 MSP產(chǎn)物測(cè)序

將MSP擴(kuò)增產(chǎn)物50 μ送檢測(cè)序，測(cè)序結(jié)果運(yùn)用DNA star軟件進(jìn)行比對(duì)分析。

1.2.3 mRNA提取

使用TRI zol法提取單個(gè)核細(xì)胞總RNA，RNA小量制備試劑盒分離柱純化RNA，合成cDNA，進(jìn)行定量PCR反應(yīng)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)利用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。甲基化分析采用x2檢驗(yàn)，基因表達(dá)分析進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 甲基化狀態(tài)

60例多發(fā)性骨髓瘤患者中檢出WT1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化陽(yáng)性率為21.66%（13/60）；30例對(duì)照組WT1基因甲基化陽(yáng)性率為0.00%（0/30），二者對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 MSP產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果

多發(fā)性骨髓瘤患者在WT1基因啟動(dòng)子區(qū)MSP產(chǎn)物檢出19處堿基發(fā)生CT轉(zhuǎn)換。

2.3 mRNA表達(dá)結(jié)果

MM患者WT1mRNA表達(dá)情況：MM組：（12.39±18.32）Fold，對(duì)照組：（13.51±26.38）Fold，MM組與對(duì)照組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義（P＞0.05）；甲基化組：（17.00±16.52）Fold，非甲基化組：（16.45±17.97）Fold；組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討 論

多發(fā)性骨髓瘤是漿細(xì)胞惡性增殖性疾病，以分泌大量異常免疫球蛋白為主要特點(diǎn)，常表現(xiàn)為乏力、骨痛、病理性骨折、腎功能不全等，多發(fā)于老年人，為不可治愈性疾病。最早于2003年由Galm等報(bào)道了利用MSP技術(shù)檢測(cè)MM中WT1基因異常甲基化的情況，研究證實(shí)：35例骨髓瘤患者及U266和XGI骨髓細(xì)胞系列WT1啟動(dòng)子區(qū)甲基化陽(yáng)性率為65.71%（23/35），WT1基因異常甲基化能使得該基因沉默。但Melzner等采用Galm等提供的引物卻沒(méi)有得到預(yù)期結(jié)果。

WT1異常甲基化在MM的發(fā)病機(jī)制中具有一定作用，其可作為監(jiān)測(cè)多發(fā)性骨髓瘤發(fā)病與治療反應(yīng)的指標(biāo)之一。WT1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化表達(dá)在60例多發(fā)性骨髓瘤患者中陽(yáng)性率為21.66%（13/60）；在30例對(duì)照組中甲基化陽(yáng)性率為0.00%（0/30），陽(yáng)性率低于國(guó)外報(bào)道，其原因可能為：本實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象多為復(fù)發(fā)患者。

[1]肖 萌,何 娟,李 艷,等.BD方案與VAD方案治療多發(fā)性骨髓瘤的療效比較[J].中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2011,40(4):352-356.

[2]王金行,趙 越,劉柏新,等.血清免疫固定電泳在多發(fā)性骨髓瘤診斷中的意義[J].廣東醫(yī)學(xué),2011,32(15):2018-2020.