過氧化物酶體增殖物激活受體γ激動劑對人結腸癌化療敏感性的研究

臧亞丹

（同濟大學，上海 200092）

惡性腫瘤中比較常見的一種是結腸癌，他的發病率在這些年里逐漸上升。目前結腸癌的治療方法是以手術為主輔助結合化療進行綜合治療。5-氟尿嘧啶5-F是結腸癌化療方案的主要藥物組成，如果5-氟尿嘧啶的用藥量過少會無法達到正常的效果，用藥量過多會使得胃腸道正常細胞與骨髓細胞的毒性增加。單獨使用5-氟尿嘧啶的利用率僅有10%～30%。為了減少他的毒性，5-氟尿嘧啶會和其他化療增敏劑等的要求一起使用。PPARγ激動劑羅格列酮是PPARγ的合成配體，和PPARγ很容易結合。本次實驗研究里我們的研究對象為人結腸癌LOVO細胞，從細胞水平和動物水平分析羅格列酮對5-氟尿嘧啶的化療增敏效果及其作用機制。

本論文實驗包括如下幾個階段。

1 實驗材料準備階段

（1）實驗動物：裸小鼠，雌性，5周齡左右，體質量20g左右，SPF級條件下飼養。

（2）細胞株：人結腸癌LOVO細胞株，在5% CO2、37℃ 環境下，在含有100 U/mL盤尼西林Penicillin、100 U/mL鏈霉素streptomycin、10%新生牛血清的Dulbecco's Modified Wagle Medium高糖培養基中培養結腸癌細胞。挑選出對數生長期細胞。

2 動物實驗階段

（1）荷瘤裸小鼠模型：腫瘤細胞移植的部位選在裸小鼠的后背右側皮下。用生理鹽水洗滌對數期生長的LOVO細胞，通過生理鹽水重懸計數的辦法，接種數量為5×106/只的LOVO細胞。

（2）實驗分組：腫瘤細胞移植14天后，隨機把荷瘤裸小鼠五只為一組，分成四組。分別是對照組、羅格列酮組、5-氟尿嘧啶組、和5-氟尿嘧啶&羅格列酮聯合用藥組。4組分別用純生理鹽水、5-氟尿嘧啶配制的生理鹽水、羅格列酮配制的生理鹽水、5-氟尿嘧啶和羅格列酮共同配制的生理鹽水灌胃給藥，連續14天。

（3）瘤體測量、體質量和數據處理：測定荷瘤裸小鼠瘤體最短徑和最長徑，并稱量體質量，計算腫瘤體積，并計算抑瘤率。給藥14天后把裸小鼠處死，取瘤塊并稱瘤質量。

3 細胞實驗階段

（1）四甲基偶氮唑鹽法測定細胞增殖情況：在96孔培養板上接種對數期生長的細胞。在5% CO2、37℃孵育，考慮到分組的要求，各組采取不同處理因素，每一組設置五個復孔進行培養16～48小時，每孔加入20 μL濃度為5 mg/mL即0.5%四甲基偶氮唑鹽，繼續培養四小時后離心去除上清，每個孔加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩，等到甲臜完全溶解以后，用酶聯免疫檢測儀在波長490 nm處用酶標儀讀取OD值，計算細胞存活率。

（2）細胞形態觀察：在6孔培養板上接種取對數期生長的LOVO細胞，在細胞作用不同處理因素四十八小時，然后于熒光倒置顯微鏡下進行查看、攝片。

（3）染色并檢測細胞核形態：用Hoechst 33342對結腸癌細胞標記，每孔加入熒光染料Hoechst 33342 1mL，在37℃下避光熒光染色20 min，染色充分后在熒光顯微鏡下進行查看、攝片。

（4）細胞周期分布檢測：結腸癌細胞經5-氟尿嘧啶、羅格列酮及5-氟尿嘧啶&羅格列酮聯合處理四十八小時后，把細胞收集起來，并用磷酸緩沖鹽溶液進行洗滌，沉淀用事先冷卻的濃度為70%的乙醇固定足夠的時間。

（5）蛋白質印跡法檢測細胞周期蛋白、周期蛋白依賴性激酶2和細胞周期蛋白A1的表達：結腸癌細胞經羅格列酮或/和5-氟尿嘧啶處理四十八小時。RIPA裂解液（RIPA Lysis Buffer）是細胞組織快速裂解液，用它把蛋白提取出來，使用BCA蛋白濃度檢測法對提取出的蛋白濃度進行測定，使用12%分離膠將等量樣品電泳分離，把蛋白轉移到NC膜上，按步驟進行三次如下實驗：封閉、一抗孵育、洗膜、二抗孵育、洗膜、顯影。

（6）統計分析：數據分析使用SPSS13.0統計軟件（SPSS Inc，Chicago，IL，USA），進行方差分析及組間比較，當P＜0.05可以認為有統計學意義的顯著差異。

實驗表明，羅格列酮能夠增強5-氟尿嘧啶對人結腸癌結腸癌細胞的生長抑制作用，這種作用與其促進細胞凋亡以及細胞S期周期阻滯有關，本研究可為臨床上抗腫瘤藥物的研發提供了理論依據。

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