P2X受體拮抗劑對大鼠腦缺血性損傷后神經(jīng)元的保護作用

張艷艷 鄭曉紅 張筱英

缺血性腦卒中是目前導(dǎo)致患者死亡的三大主要病因之一，而幸存者也大多遺留永久性殘疾，其不僅嚴(yán)重威脅人類健康，還給社會和家庭造成了巨大的負(fù)擔(dān)。盡早恢復(fù)血流并積極采取腦保護治療是治療急性腦缺血的主要措施，在時間窗內(nèi)靜脈或動脈溶栓是目前比較認(rèn)可和有效的方法，而腦保護劑療效仍有待研究者進一步證實。研究發(fā)現(xiàn)腦缺血缺氧情況下，損傷后的神經(jīng)元釋放三磷酸腺苷（ATP）至胞外［1-2］，激活其配體門控性通道P2X受體（ATP受體亞型）［3-4］，進一步激活小膠質(zhì)細(xì)胞，而過度活化的小膠質(zhì)細(xì)胞可釋放一氧化氮合酶、促炎因子等物質(zhì)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)進一步損傷神經(jīng)元，而阻斷小膠質(zhì)細(xì)胞的過度活化可減少炎癥因子的釋放，降低缺血導(dǎo)致的神經(jīng)損傷。本研究擬探討P2X受體拮抗劑（TNP-ATP、PPADS）在大鼠腦缺血性損傷后對神經(jīng)元的保護作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 Sprague-Dawley 成年健康雄性大鼠280～360g，購自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心。

1.2 主要試劑與儀器 （1）TNP-ATP試劑盒：美國，Molecular Probes公司。（2）PPADS試劑盒：美國，Sigma Aldrich公司。（3）腦立體定向儀：深圳，瑞沃德公司。（4）電子顯微鏡：日本，Olympus公司。

1.3 方法 （1）大鼠MCAO模型的建立：采用線栓法堵塞大腦中動脈制作腦梗死模型（MCAO）［5］，缺血90min后抽出栓線即可造成再灌注模型。模型成功的標(biāo)志為大鼠手術(shù)麻醉清醒后出現(xiàn)左側(cè)肢體癱瘓，站立不穩(wěn)，提尾時向一側(cè)轉(zhuǎn)圈為模型成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)。假性手術(shù)組僅作皮膚切開和血管剝離，不做栓線處理。（2）實驗分組與給藥方式：實驗動物隨機分為4組：假性手術(shù)組、腦梗死組（對照組）、腦梗死+ P2X受體拮抗劑TNP-ATP組（簡稱TNP-ATP組）、腦梗死+ P2X受體拮抗劑PPADS組（簡稱PPADS組）。給藥方式：TNP-ATP組與PPADS組在進行MCAO前30min，側(cè)腦室分別注射P2X受體拮抗劑TNP-ATP、PPADS對大鼠缺血進行干預(yù)。給藥體積為2μl，以0.5μl/min速度注射至大鼠右側(cè)側(cè)腦室（AP -0.92mm，ml 1.5mm，DV 3.5mm）。給藥濃度為PPADS 10μm；TNP-ATP 30μm。（3）組織病理學(xué)檢測：MCAO大鼠缺血90min，再灌注3d后在4%水合氯醛深麻醉下剪開胸腔，暴露心臟，經(jīng)左心室先用100 ml 生理鹽水后用200ml 4%多聚甲醛灌注固定至肝臟變白，四肢僵硬。斷頭取腦，經(jīng)10%中性福爾馬林固定過夜，70%、80%、95%以及無水酒精脫水后行石蠟包埋、切片，HE染色，顯微鏡檢查組織病理改變。（4）定量分析：電子顯微鏡拍攝海馬區(qū)神經(jīng)元圖片，使用Image J 軟件計數(shù)存活神經(jīng)元以及總神經(jīng)元數(shù)量，神經(jīng)元存活率以存活神經(jīng)元數(shù)/總神經(jīng)元數(shù)計算。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用Graphpad Prism 5 統(tǒng)計軟件。計量資料以（s）表示，數(shù)據(jù)采用單因素方差分析結(jié)合Bonferroni post-test。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織病理改變 假性手術(shù)組大鼠海馬神經(jīng)元排列緊密整齊，胞核呈圓形或者橢圓形，核膜、核仁結(jié)構(gòu)明顯，染色質(zhì)淡染，胞漿體積較小，呈淡紅色；腦梗死組大鼠海馬神經(jīng)元死亡明顯增多，胞核固縮成深紫色小點，胞漿相對明顯，染色較深；TNP-ATP組亦有較多神經(jīng)元表現(xiàn)出死亡的形態(tài)學(xué)特征；PPADS組大鼠死亡的海馬神經(jīng)元較腦梗死組明顯減少。

2.2 神經(jīng)元存活率 假性手術(shù)組為100%，腦梗死組為（34.9±2.627）%，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），顯示MCAO模型成功，有明確的神經(jīng)元損傷；TNP-ATP組為（40.6±4.366）%，神經(jīng)元存活率較腦梗死組有提高，但兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；PPADS組為（67.9±1.305）%，神經(jīng)元存活率明顯提高，與腦梗死組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

3 討論

理想的腦卒中治療的靶點是能發(fā)揮神經(jīng)保護作用和減輕神經(jīng)毒性作用并在多種腦細(xì)胞類型上都可產(chǎn)生作用的神經(jīng)血管信號。嘌呤能受體主要分為兩大類：腺苷受體（P1）和三磷酸腺苷（ATP）受體（P2）。P1受體主要由腺苷激活，P2受體主要由ATP和ADP激活。P2受體又可分為P2X 和P2Y亞型。P2Y受體是G蛋白偶聯(lián)受體。P2X受體是配體ATP門控型離子通道。目前已有7種 P2X 受體亞型（P2X1-7）被成功克隆。P2X4、P2X7受體廣泛分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，其中腦內(nèi)主要分布于海馬、嗅球及大腦皮層等。在對不同的腦損傷模型的研究表明嘌呤類受體參與神經(jīng)損傷及神經(jīng)再生［1-4，6］。腦缺血損傷后的神經(jīng)元釋放 ATP 至胞外［1-2］，激活 P2X 受體［3-4］，進一步激活小膠質(zhì)細(xì)胞，誘發(fā)一系列炎癥反應(yīng)繼而加重腦缺血損傷。P2X受體拮抗劑能阻止小膠質(zhì)細(xì)胞過度活化所帶來的對周圍組織細(xì)胞的損害作用，從而保護腦組織不受進一步的損害。

本研究采用線栓法堵塞大腦中動脈制作大鼠腦梗死模型，研究腦缺血后海馬神經(jīng)元的損傷及P2X受體拮抗劑對其保護作用。海馬是腦組織對缺血、缺氧最敏感的部位之一，因此本研究選擇海馬部位進行研究；并以神經(jīng)元存活率（存活神經(jīng)元數(shù)/總神經(jīng)元數(shù)）作為神經(jīng)保護的指標(biāo)。結(jié)果腦梗死組大鼠海馬神經(jīng)元死亡明顯增多，胞核固縮成深紫色小點，胞漿相對明顯，染色較深，神經(jīng)元存活率僅為（34.9±2.627）%；TNP-ATP拮抗劑組神經(jīng)元存活率有提高，為（40.6±4.366）%，但與腦梗死組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；PPADS拮抗劑組神經(jīng)元存活率明顯提高，為（67.9±1.305）%，與腦梗死組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。研究結(jié)果表明大鼠腦缺血性損傷后P2X受體介導(dǎo)了小膠質(zhì)細(xì)胞活化及炎癥反應(yīng)，并進一步損傷神經(jīng)元，P2X受體拮抗劑對大鼠腦缺血后神經(jīng)元有保護作用，其中PPADS對腦缺血后神經(jīng)元有明顯的保護作用，差異有顯著性；TNP-ATP對腦缺血后神經(jīng)元亦有一定的保護作用，但差異無顯著性。PPADS為P2X1-3，5，7受體拮抗劑，TNP-ATP為P2X1-4受體拮抗劑。P2X5受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達較低，而P2X7受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)細(xì)胞高表達［7］，故作者推測P2X7受體參與了腦缺血后的炎癥反應(yīng)，繼而加重腦缺血損傷；PPADS可能通過抑制P2X7受體功能阻止了腦缺血后的炎癥反應(yīng)，從而減少了進一步的腦損傷；這也可能是腦缺血損傷治療的一個潛在性的藥物干預(yù)靶點，P2X受體特異性拮抗劑的選擇，將會是以后研究的重點。