乙酰肝素酶介導心肌細胞凋亡的研究

曹洪帥，韓軒茂*

（1.內蒙古科技大學包頭醫學院，內蒙古 包頭 014040；2.包頭醫學院第一附屬醫院心內一科，內蒙古 包頭 014040）

硫酸乙酰肝素酶（HPSE）是一種內切性β-D-葡萄糖醛酸糖苷酶，是哺乳動物細胞中唯一可以切割細胞表面的硫酸乙酰肝素側鏈的酶，參加細胞外重塑。HPSE涉及多種生理過程如胚胎植入，組織修復和炎癥過程；病理致病過程主要包括腫瘤的進展和腎臟疾病[1]。研究表明，HPSE在多種惡性腫瘤病理發展過程中呈現高表達、高活性狀態，有可能成為一個抗腫瘤治療的新靶點[2]。HPSE作為一個新的靶向治療位點正在逐漸被人們所認識。近期發現，HPSE在大鼠缺血再灌注損傷（I/R）模型中有影響作用[3]，但迄今為止，尚未見缺血過程中心肌細胞自身HPSE表達、調控及凋亡的研究報告。本實驗通過培養H9C2心肌細胞，復制缺氧/復氧損傷模型，模擬臨床上MIRI，并用HPSE抑制劑進行干預，進而探討HPSE對H9C2心肌細胞缺氧/復氧損傷后的影響作用。

1 資料與方法

1.1 實驗藥物

OGT2115

1.2 細胞

H9C2心肌細胞（武漢普諾賽生命科技有限公司）

1.3 試劑

DMEM高糖培養基，胰酶，PBS，胎牛血清，MTT粉末，青霉素鏈霉素混合液，DMSO。

1.4 儀器

CO2培養箱，熒光倒置顯微鏡，酶標儀。

1.5 方法

1.5.1 細胞培養

配置培養基：10%胎牛血清（BSA）、1%青霉素鏈霉素混合液的DMEM培養基。培養 H9C2心肌細胞，置于常規培養箱培養，待細胞生長80%滿時，進行細胞傳代，2～3天傳代1次，用于后續實驗。

1.5.2 復制H9C2心肌細胞缺氧/復氧模型

細胞生長80%滿后，將細胞的培養基換成PBS，置于缺氧裝置中孵育4h（缺氧時間超過時，許多調亡細胞團漂浮于培養基中，易造成極大誤差，因此本實驗細胞缺氧時間定為4h），缺氧處理后更換含10%BSA 的DMEM培養基，置于常規培養箱中培養3 h，模型建立完成。

1.5.3 形態學觀察

在高倍顯微鏡下觀察細胞的狀態，可以通過觀察細胞狀態大致判斷細胞存活情況。

1.5.4 MTT法檢測細胞凋亡

取對數生長期的H9C2心肌細胞，以5×103/孔的密度接種于96孔板中，細胞貼壁后，試驗組分別加入不同濃度OGT2115（20、40、60、80、100 μg/mL）。每組設4個復孔。試驗組和模型組缺氧培養4 h后，換為10%胎牛血清的DMEM培養基孵育箱孵育3個小時，對照組不進行缺氧復氧操作。操作完成后，三組細胞每孔加入20 μL的MTT液體（避光），放回細胞孵箱，孵育4h，終止培養，小心吸去全部培養液。每孔加入DMSO150 uL，振蕩5～10 min，使結晶物充分溶解。酶聯免疫檢測儀在490 nm波長檢測每孔吸光度值。實驗重復3次。

2 結 果

2.1 形態學

正常狀態下H9C2心肌細胞呈梭形貼壁生長，細胞周邊顏色透亮有光澤。衰老死亡的細胞呈球形且不貼壁懸浮于細胞培養液中，通過細胞形態學對比可以看出HPSE抑制劑處理后可以明顯降低細胞凋亡率。

2.2 MTT法檢測細胞凋亡

MTT 法檢測結果（表 1）顯示，正常對照組心肌細胞存活率97.00±2.34%，H/R模型組為42.91±5.33%，H/R實驗組為60.24±7.61，缺氧處理后H9C2細胞的相對增殖率明顯下降（P＜0.05）。HPSE抑制劑處理后，H9C2細胞的相對增殖率升高（P＜0.05）。

3 討 論

心肌細胞凋亡與大部分心血管疾病的發生發展密切相關，大量研究表明，在眾多心臟疾病中如心力衰竭、心肌梗死等都存在心肌細胞凋亡形態學的改變[4]。心肌細胞凋亡在MIRI發生發展中發揮著重要作用[5]。有資料顯示[6]，I/R是急性腎衰竭和延遲移植功能的重要原因，可通過激活腎小管細胞的上皮至間質轉化（EMT）而誘導慢性腎損傷，HPSE在其中可能具有重要的作用。本實驗證實了HPSE抑制劑在缺氧復氧誘導H9C2心肌細胞凋亡過程中起保護作用。我們課題組借助乙酰肝素酶及其相關因子在白血病中表達水平的研究經驗[7]，采用多種研究方法，研究患者全身及血小板HPSE與心肌缺血再灌注的相關性；重點研究HPSE對心肌細胞的纖維化和凋亡的影響，探討HPSE在心肌缺血再灌注損傷發病中的作用，及可能的分子機制，為今后心衰的監測、治療及預后評估開辟新方向，拓寬在其他領域中，HPSE阻滯劑臨床應用范圍，具有重要的基礎及臨床意義。

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[2] Ra man K,Kuberan B.Chemical Tumor Biology of Heparan Sulfate Proteoglycans[J].Curr Chem Bio,2010,4(1):20-31.

[3] Masola V,Zaza G,Gambaro G,et al.Heparanase: A Potential New Factor Involved in the Renal Epithelial Mesenchymal Transition(EMT) Induced by Ischemia/Reperfusion (I/R) Injury[J].PLoS One.2016,11(7):e0160074.

[4] Zhang L,Cao S,Deng S.Ischemic postconditioning and pinacidil suppress calcium overload in anoxia-reoxygenation cardiomyocytes via down-regulation of the calcium-sensing receptor[J].PeerJ,2016,4:e2612.

[5] Richard RN,Douglas LM.Apoptosis and the heart:A decade ofprogress[J].Molcell Cardiol,2005,38(1):1-2.

[6] Masola V,Granata S,Bellin G,et al.Specific heparanase inhibition reverses glucose-induced mesothelial-to-mesenchymal transition[J].Nephrol Dial Transplant.2017,32(7):1145-1154.

[7] 張冬霞,李志芹,云 雁.乙酰肝素酶及其相關因子mRNA在白血病細胞中的表達[J].白血病.淋巴瘤. 2015;25(6): 359-362.