拉喹莫德對中樞神經系統脫髓鞘小鼠胼胝體區少突膠質細胞的保護作用

劉思含，耿德勤，吳明鳳，劉芷含

雙環己酮草酰二腙(CPZ)誘導的脫髓鞘動物模型是CNS脫髓鞘疾病常見的研究模型之一。拉喹莫德(LAQ)是一種新型的免疫調節藥物，近年來它被建議作為多發性硬化治療的口服制劑。過去動物研究表明，它有抗炎、抑制抗原表達的基因等作用，但目前拉喹莫德作用機制尚未充分理解。研究[1-2]發現，拉喹莫德能減輕實驗性變態反應性腦脊髓炎(EAE)及CPZ造模小鼠胼胝體區髓鞘脫失癥狀，但目前它保護神經功能的機制尚不清楚。本研究通過應用拉喹莫德，觀察其對CPZ誘導的CNS脫髓鞘小鼠胼胝體區髓鞘堿性蛋白(MBP)、膠質纖維酸性蛋白(GFAP)及其分泌的TNF-α和IL-1β表達的影響，以探討LAQ對髓鞘保護的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組 80只健康雄性C57BL/6小鼠，體質量23～25 g，由徐州醫科大學實驗動物中心提供。隨機分為正常對照組(20只)、CPZ模型組(40只)及LAQ處理組(20只)。

1.1.2 主要試劑和儀器 CPZ(美國Sigma公司)；LAQ (ABR-215062)；羊血清(北京中杉金橋生物技術有限公司)；鼠抗MBP(美國Abcam公司)；雞抗GFAP(美國Abcam公司)；IL-1β 小鼠ELISA試劑盒(美國Abcam公司)；TNF alpha小鼠ELISA試劑盒(美國Abcam 公司)；冰凍切片機(德國Leica公司)；正置顯微鏡(日本Olympus BX60)。

1.2 方法

1.2.1 CPZ模型及藥物干預方法 將CPZ摻入正常飼料組成0.3%的混合粉末。正常組給予正常飼料喂養，CPZ組給予喂養含有0.3% CPZ混合飼料，LAQ處理組喂食0.3% CPZ混合飼料同時給予LAQ灌胃(25 mg/kg)，每日1次，共8周。

1.2.2 MBP及GFAP免疫熒光檢測 采用免疫熒光法檢測腦組織MBP及GFAP陽性細胞分布。制備小鼠脫髓鞘后, 將CPZ組各時間點(0 d, 3 d, 7 d, 2周, 4周, 8周)小鼠(均隨機取3只)經10%水合氯醛(1 ml/kg)腹腔注射麻醉，迅速開胸暴露心臟。經左心室快生理鹽水沖洗，4 ℃多聚甲醛灌注、固定24 h。常規冰凍切片包埋劑(OCT)包埋后，在冰凍切片機上行連續冠狀面切片(片厚20 μm)，選取小鼠前囟前后胼胝體部位，進行MBP和GFAP雙重染色，并行DAPI熒光染色后置于正置顯微鏡下觀察拍照。

1.2.3 MBP及GFAP蛋白水平的檢測 采用免疫印跡法檢測小鼠胼胝體區的MBP及GFAP蛋白的水平。每組于各時間點隨機取3只小鼠，深麻醉后迅速處死，快速剝離腦組織，冰上操作去除皮質只保留胼胝體組織；取新鮮胼胝體組織300 mg。加入蛋白裂解液(RIPA裂解緩沖液)，勻漿，12 000 r/min離心30 min，分離上清。利用二辛可酸(BCA)法蛋白定量加入等體積的5×SDS buffer，99 ℃煮沸10 min變性，-80 ℃保存。總蛋白上樣；經過SDS-聚乙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳、硝酸纖維素膜(NC)轉膜、5%脫脂奶粉封閉，加入一抗或β-actin抗體4 ℃抗體過夜；洗膜后加入二抗，室溫孵育2 h；洗膜，采用Odyssey 近紅外雙色激光成像系統拍照，利用Image J軟件測定條帶灰度值，計算MBP及GFAP蛋白條帶總灰度與β-actin蛋白條帶總灰度的比值作為MBP和GFAP蛋白相對水平。

1.2.4 TNF-α、IL-1β含量的檢測 實驗結束后取胼胝體，用冰生理鹽水在冰浴下制成20%的混懸液。4 ℃ 4000 r/min 離心15 min，取上清液于-20 ℃冰箱待測。采用ELISA法檢測受試小鼠各個時間點(0 d, 7 d, 2周, 4周, 8周)腦胼胝體中TNF-α、IL-1β蛋白含量，具體操作步驟嚴格按TNF-α、IL-1β定量ELISA說明書。

2 結 果

2.1 CPZ組小鼠腦組織胼胝體區MBP及GFAP染色情況 見圖1。給予CPZ口服藥物后立即處死小鼠觀察發現胼胝體區MBP分布均勻，呈絲網狀(圖1A)；其中散在稀疏且形態纖細的GFAP陽性細胞(圖1B)。造模3 d后，MBP陽性細胞分布較前減少(圖1E)，GFAP細胞體增生，總體細胞形態稍肥大(圖1F)。脫髓鞘7 d后，MBP陽性細胞分布減少(圖1I)，GFAP數量顯著增多，著色深，胞體腫脹，突起增多且長(圖1J)；脫髓鞘2周后，MBP陽性細胞分布稀疏而短小(圖1M)，GFAP陽性細胞胞體腫大，突起顯著增長，分布密集(圖1N)。脫髓鞘4周后，MBP陽性細胞著色淺，呈散在分布(圖1Q)；GFAP陽性細胞密度增加、胞體腫脹且突起增多，病灶邊緣處增生更明顯(圖1R)。脫髓鞘8周后MBP分布稍增多(圖1U)，GFAP陽性細胞形態肥大、突起交錯，已形成膠質瘢痕(圖1V)。

2.2 各組小鼠腦組織胼胝體區MBP和GFAP蛋白的比較 見圖2、表1。正常組小鼠各個時間點未有髓鞘堿性蛋白和膠質纖維酸性蛋白表達的顯著改變。與CPZ組比較，LAQ組在4周、8周時MBP表達量增多(均P<0.05)；GFAP于7 d、2周、4周和8周表達量顯著減少(均P<0.05)。

2.3 各組小鼠腦組織胼胝體區TNF-α及IL-1β含量的比較 見表2。CPZ組和LAQ組的兩種炎癥因子表達均高于正常組(均P<0.05)。與CPZ組相比，LAQ組TNF-α及IL-1β表達隨著時間的增加而逐漸下降，于2周、4周和8周蛋白表達均有統計學意義(均P<0.05)。

圖1CPZ組胼胝體區MBP和GFAP表達MBP陽性細胞表達為紅色絮狀物，GFAP陽性細胞表達為綠色條索樣物，細胞核為藍色顆粒；V圖箭頭指向CPZ組8周出現的膠質瘢痕(免疫熒光染色，×400)

圖2 CPZ組和LAQ組各個時間點MBP及GFAP蛋白的表達。A：CPZ組；B：LAQ組

表2 各組小鼠各個時間點胼胝體區TNF?α及IL?1β表達的比較(x±s)組別指標(pg/ml)0d7d2周4周8周正常組msTNF?α97．52±18．2598．12±1．26101．20±19．31100．53±7．92105．83±7．20CPZ組msTNF?α100．32±19．29127．12±3．50142．30±12．64162．16±19．43187．39±20．11LAQ組msTNF?α93．19±18．23122．19±9．23#130．92±29．12?#141．45±19．43?#159．39±19．21?#正常組msIL?1β93．74±20．4197．10±13．63#93．72±1．34#102．32±20．30#103．83±12．34#CPZ組msIL?1β94．28±27．52140．21±15．34#153．52±3．25#183．23±3．23#228．74±19．64#LAQ組msIL?1β93．02±21．95130．46±19．54#139．67±1．56?#148．40±2．89?#160．13±21．34?# 注：與CPZ組比較?P<005，與正常組相比較#P<005

3 討 論

多發性硬化是一種CNS自身免疫系統疾病[3]。它的病理機制復雜，目前認為是髓鞘脫失、軸索變性、炎癥浸潤、膠質細胞增生填充組織缺損區域形成硬化斑有關[4]。近年來，星形膠質細胞在白質脫髓鞘的作用越來越受到重視。GFAP為星形膠質細胞的骨架和特異性標記物被廣泛研究。曾有研究[5]發現，0.2% CPZ混合飼料喂食6周恢復正常飲食后，活化的星形膠質細胞可以減輕髓鞘脫失的損害。然而，另一些學者[6]認為慢性脫髓鞘疾病中活化的星形膠質細胞還可以激活核因子-kB通路，產生和釋放TNF-α、IL-17等細胞炎性因子，最終生成神經毒性物質如一氧化氮，抑制了髓鞘的再生[7]。

本實驗采用CPZ脫髓鞘動物模型后發現新型免疫調節劑LAQ對小鼠胼胝體區域少突膠質細胞的存活、星形膠質細胞的激活及其炎性因子的分泌存在一定的作用。以往實驗采用EAE模型模擬CNS脫髓鞘的病理狀態，但相比EAE模型，CPZ作為一種選擇性銅離子螯合劑，可以穩定的誘導少突膠質細胞凋亡導致髓鞘的瓦解。因而，它更有利于開展脫髓鞘和髓鞘再生修復的研究[8-9]。本研究發現小鼠喂食CPZ混合飼料后胼胝體區MBP標記的少突膠質細胞數量逐漸減少，分布稀疏且松散，并于4周降至最低，8周時可見少許髓鞘再生；以上結果均表明了CPZ模型建立成功。然而隨著脫髓鞘時間的延長，胼胝體區域星形膠質細胞逐漸增殖、活化，胞體腫脹，突起粗大、卷曲，填補缺損，且陽性細胞數量于4周時增至峰值，8周稍降低。隨后本研究又采用了免疫印跡法分析各個時間點MBP及GFAP蛋白的動態水平，發現其變化趨勢與免疫熒光結果一致。綜上所述，本研究認為CPZ導致少突膠質細胞的損傷與星形膠質細胞的增殖、活化有關。

已有臨床實驗[10-11]證明，LAQ作為一種口服新型試驗性免疫調節藥物對復發緩解型多發性硬化(RRMS)有抗炎和神經保護性能。動物實驗研究[12]顯示它可以使Th1(T輔助Ⅰ細胞，產生促炎性細胞因子)向Th2(T輔助Ⅱ細胞，產生抗炎性細胞因子)的具有抗炎性特征的轉化。另一實驗[13]證明，EAE模型小鼠服用LAQ后脊髓損害部位脫髓鞘程度顯著降低，從而保護了脊髓軸突和神經元的功能。然而，目前尚未有明確結論解釋LAQ保護髓鞘的機制。本實驗通過免疫印跡法研究發現LAQ治療CPZ脫髓鞘小鼠后髓鞘標記物MBP蛋白表達量于4周、8周顯著升高，而GFAP蛋白表達量于7 d、2周、4周及8周顯著降低；提示了LAQ可能通過抑制了活化的星形膠質細胞參與了脫髓鞘模型后期髓鞘修復及再生的過程。

為了進一步探討拉喹莫德保護髓鞘的機制，本研究在各個時間點(0 d，7 d，2周，4周，8周)采用ELISA技術檢測激活的星形膠質細胞分泌的炎性因子IL-1β和TNF-α的動態改變。Sugama等[14]認為活化的星形膠質細胞大量釋放IL-1β從而啟動腦內免疫過程。解迪等[15]證明了膿毒癥新生幼鼠腦胼胝體內的IL-1β與IL-1R1相互作用抑制ERK通道的激活導致少突膠質前體細胞分化成熟障礙，最終導致軸突低髓鞘化。TNF-α也是參與炎癥反應的主要細胞之一[16]。動物實驗[17]證實了TNF-α可通過少突膠質細胞的TNF/p55TNF信號通路導致少突膠質細胞的凋亡。以上均提示IL-1β和TNF-α可導致少突膠質細胞的損傷。本實驗結果發現，LAQ組IL-1β和TNF-α表達逐漸降低，相比CPZ組于2周、4周、8周有顯著性差異。

本實驗證實，LAQ可以減輕CPZ介導的脫髓鞘模型小鼠胼胝體區少突膠質細胞的損傷，可能與抑制星形膠質細胞的活化及其分泌的炎癥因子的表達有關；從而達到保護髓鞘和神經系統的功能。

[1] Wegner C, Stadelmann C, Pf?rtner R, et al. Laquinimod interferes with migratory capacity of T cells and reduces IL-17 levels, inflammatory demyelination and acute axonal damage in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis[J]. J Neuroimmunol, 2010, 227: 133.

[2] Brück W, Pf?rtner R, Pham T, et al. Reduced astrocytic NF-κB activation by laquinimod protects from cuprizone-induced demyelination[J]. Acta Neuropathol, 2012, 124: 411.

[3] Sospedra M, Martin R. Immunology of multiple sclerosis[J]. Semin Neurol, 2016，36: 115.

[4] Popescu BF, Pirko I, Lucchinetti CF. Pathology of multiple sclerosis: where do we stand?[J]. Continuum (Minneap Minn), 2013, 19: 901.

[5] 宋大為，范凱，張艷麗，等．星形膠質細胞在cuprizone介導的急性脫髓動物模型中的變化及其意義[J]．中國臨床解剖學雜志，2007，25：540.

[6] Raasch J, Zeller N, Van Loo G, et al. IkappaB kinase 2 determines oligodendrocyte loss by non-cell-autonomous activation of NF-kappaB in the central nervous system[J]. Brain, 2011, 134: 1184.

[7] Smith KJ, Kapoor R, Felts PA. Demyelination: the role of reactive Oxygen and Nitrogen species[J]. Brain Pathol, 1999, 9: 69.

[8] Matsushima GK, Morell P. The neurotoxicant, cuprizone,as a model to study demyelination and remyelination in the central nervous system[J]. Brain Pathol, 2001,11: 107.

[9] Ransohoff RM. Animal models of multiple sclerosis: the good, the bad and the Bottom line[J]. Nat Neurosci, 2012, 15: 1074.

[10] 周官恩，安中平．多發性硬化口服藥物研究新進展[J]．中國現代神經疾病雜志，2012，12：147.

[11] Moore S, Khalaj AJ, Yoon J, et al. Therapeutic laquinimod treatment decreases inflammation, initiates axon remyelination, and improves motor deficit in a mouse model of multiple sclerosis[J]. Brain Behav, 2013, 3: 664.

[12] Brunmark C, Runstr?m A, Ohlsson L, et al. The new orally active immunoregulator laquinimod (ABR-215062) effectively inhibits development and relapses of experimental autoimmune encephalomyelitis[J]. J Neuroimmunol, 2002, 130: 163.

[13] Yang JS, Xu LY, Xiao BG, et al. Laquinimod (ABR-215062) suppresses the development of experimental autoimmune encephalomyelitis, modulates the Th1/Th2 balance and induces the Th3 cytokine TGF-beta in Lewis rats[J]. J Neuroimmunol, 2004, 156: 3.

[14] Sugama S, Takenouchi T, Sekiyama K, et al. Immunological responses of astroglia in the rat brain under acute stress: interleukin 1 beta co-localized in astroglia[J]. Neuroscience, 2011, 192: 429.

[15] 解迪，曾紅科，陳純波，等．IL-1β對膿毒癥新生幼鼠胼胝體內少突膠質細胞前體細胞分化成熟的影響[J]．中國病理生理雜志，2015，31：385.

[16] Edwards MM, Robinson SR. TNF alpha affects the expression of GFAP and S100B: implications for Alzheimer’s disease[J]. J Neural Transm, 2006, 113: 1709.

[17] Akassoglou K, Bauer J, Kassiotis G, et al. Oligodendrocyte apoptosis and primary demyelination induced by local TNF/p55TNF receptor signaling in the central nervous system of transgenic mice: models for multiple sclerosis with primary oligodendrogliopathy[J]. Am J Pathol, 1998, 153: 801.