黃連解毒湯治療阿爾茨海默病作用機制研究進展

顧欣如王宏潔楊健司南趙海譽方思月邊寶林

1.中國中醫科學院中藥研究所 北京 100700 2.北京中醫藥大學

世界范圍內，阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）已成為引發老年人死亡的第四大病因。我國 AD患病人數以990萬位居世界第一，65歲以上老人發病率約為6.5%，嚴重影響老年人生活質量，高額醫療費用給家人及社會帶來沉重經濟負擔。以β淀粉樣蛋白（Aβ）為靶標的單克隆抗體藥物在III期臨床屢遭失敗[1]。隨著近年對AD發病機制的研究，腦內中樞神經系統慢性炎癥及脂質代謝異常成為其重要的病理特征。王永炎院士在多年臨床實踐基礎上提出“毒損腦絡”的嶄新理論[2]，該理論的提出大大推動了中醫腦病學的發展，也為中醫對AD病機的認識以及治療提供了新思路。黃連解毒湯為清熱解毒代表方劑，始載于《肘后備急方》[3]。方中以黃連為君，瀉中焦之火，清心經之熱；黃芩為臣，瀉上焦之火，清肺熱；黃柏為佐，瀉下焦之火，清腎經虛熱；梔子為使，通瀉三焦之火，導火下行。四藥合用，苦寒直折，使火邪去而熱毒解，諸癥可愈?，F代藥理研究表明，黃連解毒湯具有抗炎、抗氧化、調節腸道菌群、改善膽固醇代謝等活性，臨床對腫瘤、腦缺血、肝損傷、II型糖尿病和老年性癡呆等疾病具有良好作用[4-10]。基于黃連解毒湯的多靶點作用機制以及AD的發病機制不清、病理特征多樣的特點，本文在參考大量文獻的基礎上，分類整理，圍繞炎癥、氧化應激、脂代謝異常及菌群失調等方面，總結黃連解毒湯在AD藥理研究進展，同時為清熱解毒方藥在治療AD研究中提供思路。

1 改善阿爾茨海默病患者癡呆癥狀

在臨床應用中，黃連解毒湯連續使用3個月后可明顯改善AD患者智力和生活能力，并且紅細胞超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活性及血漿脂質過氧化物（lipid peroxide,LPO）含量指標也較治療前有顯著差異性（P＜0.01）[11]。令人振奮的是，在與腦復康片（酰胺吡酮）、都可喜（吡拉西坦）等進行的臨床隨機對照試驗中，黃連解毒湯顯示了與化學藥物療效相當的治療效果[12]。王帆等[13]總結了近年來有關黃連解毒湯相關的研究資料，進一步明確了AD辨證施治中黃連解毒湯的重要地位并提供了現代理論支持。黃連解毒湯能明顯改善AD的臨床癥狀，總有效率77.27%，石杉堿甲對照組總有效率達58.33%，經統計學分析，治療組療效優于對照組（P＜0.05）。徐雷[14]報道黃連解毒湯能夠有效改善AD患者的臨床癥狀，提高其日常生活能力，其機制可能與黃連解毒湯能有效清除腦內β-淀粉樣蛋白，降低腦內細胞炎性因子有關。AD日益成為危及老年人健康、影響老年人生活質量的主要不利因素?；谥兴幵诼圆≈委熒系膬瀯荩S連解毒湯抗AD活性物質基礎的深入研究對于解決我國AD患者痛苦，減輕醫療費用負擔具有深遠的意義。

2 治療阿爾茨海默病的作用機制

2.1 緩解中樞慢性炎癥反應 中醫學認為“毒損腦絡”是AD的重要病機之一，外邪化熱成毒，損傷腦絡，從而導致腦竅壅塞，神機失靈而發為癡呆[15]?，F代醫學認為，AD是一種神經系統退行性病變，β淀粉樣蛋白沉積形成的老年斑，tau蛋白過度磷酸化導致的神經纖維纏結，以及神經元丟失伴膠質細胞增生是AD發作的主要病理特征。Aβ異常分泌，在腦組織內沉積，對周圍的突觸和神經元具有毒性作用，破壞突觸后膜，最終引起神經細胞死亡。近年來以Aβ為靶標的單克隆抗體藥物在Ⅲ期臨床屢遭失敗，西藥治療出現瓶頸。2000年，神經免疫炎癥概念正式提出，炎癥反應被認為是 Aβ沉積所引起的局部繼發性反應，同時又是中樞神經系統（central nervous system,CNS）退行性變的重要因素。小膠質細胞（microglia）是定居在腦內的吞噬細胞，是 CNS中的第一道也是最主要的一道免疫防線，能清除中樞神經系統中損壞的神經、斑塊及感染性物質。然而過量的 Aβ堆積能夠刺激小膠質細胞釋放炎癥因子；白介素-1（IL-1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、NO 等神經毒性物質[16-17]，而這些細胞因子又會刺激小膠質細胞釋放活性氧，促進其分裂增殖。黃連解毒湯具有苦寒之性，是清熱解毒的經典方，可有效地緩解內毒蘊積、熱傷腦絡之證。黃連解毒湯一直以來即用于治療急性傳染性疾病和感染性疾病,現代藥理學研究表明其具有良好的抗菌、消炎、提高免疫功能的作用。黃連解毒湯能明顯降低毛細管通透性，對二甲苯誘發的小鼠耳廓水腫有顯著影響，表明黃連解毒湯具有抗炎鎮痛的作用[18]。還可以降低高脂血癥小鼠血清中內毒素、TNF-α和IL-6的水平，其抗炎作用類似抗生素[19]。任維等[20]采用 UPLC-QQQ-MS檢測方法，分析了生物堿、黃酮及環烯醚萜三大類成分的體內消長變化，證實了藥物在“實熱火毒”證動物體內的作用與正常狀態不同，同時發現黃連解毒湯能下調與炎癥相關的促炎因子（TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10 和 MIP-2）的含量，藥代和藥效結合分析，初步闡釋了黃連解毒湯抗炎的藥效物質基礎及可能的作用機理。流行病學發現許多能量代謝異常均與AD有關，而調節能量代謝的腺苷酸激活蛋白激酶（activated protein kinase,AMPK）在AD發病過程中起重要作用[21]。在體外實驗中發現，黃連解毒湯可以增強AMPK的活性，抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的巨噬細胞中核因子-κB（nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells，NF-κB）信號通路和大鼠嗜堿性白細胞中Lyn激酶介導的信號通路，從而改善細胞內炎癥和過敏反應[22]。

2.2 改善阿爾茨海默病氧化應激狀態 腦組織約占人體總重的2%～3%，而其耗氧量卻是人體總耗氧量的20%。在人體衰老的自然過程以及腦缺血狀態下,機體內會有大量自由基，從而導致體內氧化和抗氧化系統失衡，SOD、過氧化氫酶（catalase,CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）等抗氧化的活性降低，產生大量的活性氧（reactive oxygen species,ROS）、活性氮（reactive nitrogen species,RNS）等自由基[23]，一氧化氮（nitric oxide，NO）與超氧陰離子反應生成活性更強的過氧亞硝基（peroxynitrite anion，ONOO-）及·OH，破壞細胞膜的完整性，損傷線粒體、脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）和核糖核苷酸（ribonucleic acid，RNA）。強有力的證據表明 ROS和 RNS的增加引起的氧化應激和許多抗氧化防御酶功能喪失和AD有著重要關系。Aβ的神經毒性誘導氧化應激產生過量的 ROS,刺激生物膜上的多元不飽和脂肪酸發生脂質過氧化，再通過非酶解作用產生強毒性的氧化應激標志（4-hydroxy-2,3-nonenal，4-HNE），AD 患者的神經營養因子（neurotrophic factor，NTF）中存在著大量的 4-HNE促進tau蛋白神經纖維纏接的形成[22]。關于黃連解毒湯的抗氧化作用早有報告，臨床上常用于治療心腦血管疾病。血清藥理學研究表明，黃連解毒湯對 H2O2所致PC12細胞氧化應激損傷具有保護作用，并呈劑量依賴性[25]。而小檗堿可以滅活 O2、OH·、NO及OONO－等高活性分子，具有直接清除ROS的能力[24]。在腦中風模型大鼠體內，發現黃連解毒湯能夠顯著減少梗死面積，恢復 NO、丙二醛（malonaldehyde,MDA）、谷胱甘肽(glutathione，GSH)、三肽(glutathione,r-glutamyl cysteingl+glycine,GSSG)、T-SOD、Cu/zn-SOD、MN-SOD 和GSH-PX等生化指標的水平，提高自噬相關基因Beclin1和微管相關蛋白輕鏈3的表達，促進胞外信號調節激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）、蛋白激酶（protein kinase，Akt）和 3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶（phosphoinositide-dependent kinase 1,PDK1）等活性，抑制雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）、P38、同源性磷酶-張力蛋白等的活性[25]。楊新報告黃連解毒湯還可以通過調節胰島素抵抗大鼠體內MDA、SOD和GSH-PX的水平，增加對胰島素的敏感性，提高抗氧化應激能力并改善內質網應激狀態[28]。邱昕等[29]發現高、中劑量的黃連解毒湯抗自由基氧化，保護神經細胞，減少老年斑沉積的效果大于安理申。在臨床應用中，黃連解毒湯連續使用3個月后明顯改善AD患者智力和生活能力，并且紅細胞SOD活性及血漿脂過氧化物（lactoperoxidase,LPO）含量指標較之前有顯著差異性（P＜0.01）[11]。

2.3 改善阿爾茨海默病脂代謝異常 多元不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFAs）是人體內重要的生理活性物質，主要包括ω-3和ω-6多元不飽和脂肪酸。PUFAs具有限制中性粒細胞過度活化和募集、促進巨噬細胞吞噬等功能,通過對細胞浸潤、炎癥因子的分泌、細胞凋亡等多環節調控，加快抗炎促炎消退效應。其結構類型主要有來源于花生四烯酸（ω-6，Arachidonic acid,AA） 衍生的脂氧素（lipoxin,LX）系列、來源于二十碳五烯酸（ω-3，Eicosapentaenoic acid,EPA）的E系列（E series,RvE）、來源于二十碳六烯酸（ω-3，Docosahexaenoic acid,DHA）的 D系列（D series,RvD）。AD病程早期，小膠質細胞過度激活，產生大量自由基和炎性因子，慢性神經免疫炎癥隨即產生，連帶神經元損害，突觸丟失。組織學檢查顯示，AD患者海馬及腦脊液中促炎消退介質（specialized pro-resolving mediator,SPMs）、脂氧素 A4（lipoxins,LXA4）和消退素 D1（resolvin,RvD1）水平顯著下降，其對應的脂氧素代謝酶和特異性促消退介質(specialized pro—resolving mediators,SPMs)受體表達升高，且LXA4和RvD1腦脊液水平與其生前簡易能量表（mini-mental state examination,MMSE）測試成正相關[30-31]。海馬及腦脊液中SPMs，生物合成酶及下游抗炎，促炎因子成為此過程中重要的調控元件，具腦內炎癥穩態平衡生理意義[32]。AA是人體必需游離脂肪酸之一。在環氧合酶（cyclo-oxygenase,COX）和脂氧合酶（lipoxygenase,LOX）的作用下生成前列腺素類（prostaglandins,PGS）、血栓素類（thromboxanes，TXs）、白三烯類（leulotrienes，LTs）、LXs和 12-過氧化氫羥基花生四烯酸類（12-hydroxy-eicosatetraenoic acid,12-HPETE）物質，參與人體炎癥反應和免疫系統的調控。黃連解毒湯作為清熱解毒的代表方，可以顯著抑制COX-2和LOX-5的活性、減少NO合成、阻斷炎癥通路、降低炎性細胞因子含量、緩解小膠質細胞活化[33]，并且可以抑制腦內tau蛋白磷酸化關鍵蛋白激酶(protein kinases,GSK-3β)及周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK-5)活性，降低tau蛋白磷酸化水平[34-35]。臨床研究表明，AD患者總膽固醇（total cholesterol,TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）及高密度脂蛋白（high density lipoprotein,HDL）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein,LDL）水平與正常人相比有顯著差異。流行性病學及回顧性調查顯示，他汀類藥物可顯著降低AD發病率[36]，提示膽固醇合成紊亂影響AD進程，早期降血脂藥物干預對于AD發展至關重要[37]。腦內的膽固醇以24S-羥膽固醇（24S-hydroxycholesterol,HC）的形式透過血腦屏障，在LDL的轉運下移至肝臟代謝，催化24S-HC生成的24S-HC酶主要存于在腦內。腦脊液中可以測到的27-HC基本來自血漿，并依賴于血腦屏障的功能。故外周循環或腦脊液中的24S-HC水平高低能很好地反映腦內膽固醇的動態平衡。細胞研究提示，27-HC干預能提高β-分泌酶活性，增加淀粉樣前體蛋白(amyloidprecursorprotein,APP)表達和Aβ-42水平，而24-HC則是通過非淀粉樣蛋白途徑增加可溶性淀粉樣前體蛋白（secretory amyloidprecursorprotein,sAPP）的水平[38]。黃連解毒湯中黃連、黃芩、黃柏為清熱燥濕藥，梔子為清熱瀉火藥，可直接針對膽固醇堆積引起的“痰、濕、瘀”等癥發揮療效。實驗證明，服用黃連解毒湯后，血中膽固醇和甘油三酯水平明顯降低，脂蛋白脂酶（lipoprotein lipase,LPL）活性迅速增高，其作用機制涵蓋活化腺苷脫氨酶 (adenosine monophosphate,AMP)、抑制膽固醇?；D移酶 (cholesterol acyltransferase,ACAT)的活性、抑制胰蛋白脂酶的活性等方面[39]。

2.4 調節腸道菌群實現阿爾茨海默病的潛在治療作用 人的胃腸道中定植著1000多種細菌，總量約占1～2kg，編碼基因是人類基因組的150倍，被稱為人類的“第二基因組”。腸道菌群中厭氧菌約占90%，其中厚壁菌門、擬桿菌門占98%。其次為變形菌門、梭桿菌門和疣微菌門。每個人體內菌群的構成都是獨一無二的，正常狀態下，人體內菌群的種類、數量和比例相對穩定，并與宿主外部環境保持著動態平衡，但隨著人體機能正常衰弱和病理狀態下，腸道菌群會出現失調現象[40,41]。初生嬰兒的腸道菌群構成結構較為簡單，主要以雙歧桿菌為主，隨著飲食結構的改變，其腸道菌群多樣性慢慢增加，最終趨于穩定，接近成年人腸道菌群組成[42,43]。而老年人體內腸道菌群的多樣性和組成比例較成年人出現了顯著性的差異，主要以擬桿菌門和梭桿菌門為主[40]。 Cagnin.A等人利用[C11]R-PK11195和 [C11]DAA1106對AD患者大腦進行正電子發射計算機斷層顯像（position emission tomography,PET）掃描，發現小膠質細胞、腦內炎癥和認知功功能的衰退三者之間有較強的相關性[44,45]。Myles R.Minter等人[46]發現長期以抗生素（ABX）飼養APPSWE/PS1ΔE9雙轉基因AD模型小鼠而引起的腸道菌群多樣性的改變，可以影響細胞因子/趨化因子的比值，降低β-淀粉樣蛋白的沉積，減少老年斑附近的膠質增生和小膠質形態學，并以此調節腦內的炎癥反應。硝基還原酶是一種能夠降解含N化合物的細菌酶，在腸道內主要是由擬桿菌、大腸桿菌和雙歧桿菌等分泌。高脂飼料飼養的倉鼠腸道內硝基還原酶的活性增加，小檗堿在高脂飼養的倉鼠體內的生物利用度顯著高于正常組，并具有較好的降脂作用。Yang Wang等人[47]在臨床研究中發現，高脂血癥患者體內硝基還原酶的活性遠遠大于健康人（P＜0.01），口服小檗堿后，患者體內的血藥濃度顯著高于正常人（P＜0.05）,因此硝基還原酶的活性可能是小檗堿治療高脂血癥的重要生物標志物。在肝細胞中膽固醇在7α-羥化酶（hydroxylase,CYP7A1）的作用下生成具有24碳的初級膽汁酸，初級膽汁酸進入腸道協助脂質的消化，然后在腸道菌群的作用下水解生成游離的膽汁酸，再經過7位脫羥基的作用生成次級膽汁酸。大部分的膽汁酸在回腸末端重吸收參與肝腸循環，少數的次級膽汁酸（石膽酸和脫氧膽酸）不被吸收從糞便中排除。脫氧膽酸（deoxycholicacid,DCA）可以擾亂脂質雙分子層，熊脫氧膽酸（ursodeoxycholic acid,UDCA）可以增加雙分子層的穩定性，使線粒體免受損傷。高脂老鼠體內腸道菌群失調，DCA含量增加，UDCA水平下降可以進一步造成粘膜屏障功能受損[48]。哺乳動物體內的膽汁酸調節是一個復雜的過程，需要肝臟、腸道、腸道菌群的共同作用[49]。Kai He等[50]發現黃連可以降低高脂大鼠體內TC、TG、LDL-C、總膽汁酸和脂多糖的水平，增加腸道菌群中糞產堿桿菌和嗜黏蛋白阿克曼氏菌的豐度，抑制大腸桿菌、脫硫弧菌、吉氏副擬桿菌豐度。

3 結語

AD俗稱老年性癡呆癥，是一種神經退行性疾病，多發于老年人。據報道，目前我國老年人口已達到1.44億人，其中65歲以上每20人就有1人患老年癡呆，近1000萬的患病人群，占世界患病總人數的1/4。目前市場上用于治療AD的藥物有鹽酸多哌齊（安理申）1997；卡巴拉汀2000；加蘭他敏2001；美金剛2003，多數為乙酰膽堿酯酶抑制劑。而關于AD發病的機制尚不明確可能涉及的環節有:β-淀粉樣蛋白堆積，tau-蛋白過度磷酸化，自由基和氧化應激，免疫炎癥反應，中樞膽堿能異常，脂質代謝紊亂，鈣穩態失調等，因此尋找一個多環節干預治療AD的藥物迫在眉睫。而這正與中藥復方具有整體調整、綜合施治、多靶點治療的優點相吻合。黃連解毒湯以其多成分梯次發揮療效、通過炎癥表征因素（促炎癥消退介質、促炎及抗炎因子）與膽固醇生物合成代謝多環節干預、整體改善調節、使得炎癥微環境及膽固醇甾體類代謝達到新的平衡，實現AD患者病理特征[腦內神經元纏結（neurofibrillary tamgles,NFT）、老年斑（senile plaques,SP）、tau-蛋白磷酸化]及認知功能改善。因此黃連解毒湯有望成為治療AD的“新星”，但關于其發揮療效的作用機制需要進一步的深入研究。