抗結核藥物基因組學研究進展

申晨 申阿東

結核病(tuberculosis，TB)是由結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)感染引起的傳染性疾病，我國是TB高負擔國家[1]。目前，TB主要依靠化學藥物治療。由于人類基因組存在個體化差異，不同個體對藥物的反應不同。藥物基因組學(pharmacogenomics)是研究基因組或基因變異對藥物在人體內吸收、代謝、療效及不良反應產生影響的現象及其機制，從而指導新藥開發和合理用藥的一門學科[2]?？菇Y核藥物基因組學(anti-tuberculosis pharmacogenomics)以提高抗結核藥物療效及安全性為目標，致力于服務于抗結核藥物的合理化給藥、減少藥物不良反應。抗結核藥物基因組學研究主要關注藥物基因組學在抗結核治療中的應用，研究不同個體在抗結核藥物治療中包括藥物吸收、轉運、代謝、清除等在內的整個藥物代謝過程的差異性，以及由此導致不同個體用藥后的藥效和藥物不良反應產生差異性的遺傳學基礎[3-5]。

目前，WHO[6]推薦用于對抗結核藥物敏感的TB化療的一線藥物主要包括異煙肼(isoniazid，INH)、利福平(rifampin，RFP)為代表的利福霉素類(rifamycin)，以及乙胺丁醇(ethambutol，EMB)和吡嗪酰胺(pyrazinamide，PZA)。用于耐藥TB的治療藥物包括氟喹諾酮類[左氧氟沙星(levofloxacin，Lfx)、莫西沙星(moxifloxacin，Mfx)、加替沙星(gatifloxacin，Gfx)]、二線注射劑[阿米卡星(amikacin，Am)、卷曲霉素(capreomycin，Cm)、卡那霉素(kanamycin，Km)、鏈霉素(streptomycin，Sm)]、其他核心二線藥物[乙硫異煙胺(ethionamide， Eto)、丙硫異煙胺(prothionamide， Pto))、環絲氨酸(cycloserine，Cs)、特立齊酮 (terizidone，Trd)、利奈唑胺(linezolid，Lzd)、氯法齊明(clofazimi，Cfz)]等?？菇Y核藥物的組織穿透性、藥物與藥物的相互作用及其代謝的個體差異性部分由編碼藥物代謝或運輸相關通路基因的遺傳學變異所導致，遺傳決定的個體差異性在個體化治療方案的定制中起著關鍵作用。通過鑒定與抗結核藥物代謝相關的關鍵基因位點、研發能夠用于判斷抗結核藥物療效和不良反應的基因診斷技術，并以此為平臺開發基因診斷試劑盒，有助于TB個體化抗結核藥物種類和劑量的選擇，為個體化治療鋪平道理。此外，開展抗結核藥物基因組學研究有助于為新型抗結核藥物的研發提供依據。

人類基因組學研究方法

一、候選基因位點測定

通常情況下，候選基因位點的確定主要依據已報道的相關基因單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism, SNP)或突變(mutation)或納入相關通路基因的SNP位點。在鎖定目的基因位點并調取基因序列的基礎上，運用聚合酶鏈反應-限制性內切酶酶切長度多態性方法(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP)[7]、PCR結合一代測序方法[8-10]、引物特異性實時定量PCR方法或多重PCR方法[9]、飛行質譜方法[11]、基因SNP定制芯片方法[12-13]等進行候選基因位點的測定。

二、全基因組關聯分析

伴隨全基因組SNP芯片技術的發展和普及，全基因組關聯分析(genome-wide association study，GWAS)得到了較為廣泛的應用，有助于更全面地尋找抗結核藥物代謝相關的基因多態性位點[13]。

三、高通量測序技術

目前，伴隨二代和三代測序技術的研發，全外顯子測序、全基因組測序在內的高通量測序技術已經在眾多領域得到應用。二代測序技術已經應用在分枝桿菌的鑒定和分型中[14]。其在抗結核藥物基因組學的應用將有助于更為全面地揭示抗結核藥物相關遺傳學位點。

藥物基因組學與抗結核藥物代謝

目前，藥物基因組學在抗結核藥物濃度的相關性研究主要集中在一線抗結核藥物。藥物基因組學在INH代謝中起著重要作用，其在 RFP代謝中的作用也有較多關注[15]，而在其他抗結核藥物代謝中的作用報道相對較少。

一、 藥物基因組學與INH代謝

INH是重要的一線抗結核藥物，是50多年前報道的代謝個體差異的首批藥物之一，目前廣泛應用于TB和潛伏結核感染的治療。INH主要通過N-乙酰轉移酶2(NAT2)進行乙?；Щ畲x，INH的消除速率取決于NAT2的乙酰化代謝速率，而NAT2的乙酰化活性主要由其基因型決定[3,16]。基于NAT2基因型，患者可表現為慢乙?；x(純合突變等位基因)，中間代謝(NAT2*4雜合型)和快乙酰化代謝(NAT2*4野生純合型)，這些代謝差異與母體化合物及其主要代謝物的不同血清等體液水平有關。快乙?；x型治療失敗的風險較高，而慢乙?；x型致肝損傷的風險較高。慢乙?；任换蝾l率在不同人群有所不同：在因紐特人、日本人和中國人約為10%，南印度人約為60%，中東地區約為90%，美國約為72%[3]。

Parkin等[17]觀察了不同NAT2基因型個體間代謝INH的差異性，慢乙酰化個體的INH血清濃度相對其他個體(快乙?；椭械纫阴；?增高4到6倍，并基于此提出了INH的個體化給藥方案。類似地，一項研究比較了患者和健康志愿者尿液中INH的排泄，結果顯示具有較高活性NAT2等位基因的受試者INH乙酰化水平較高[18]。Verhagen等[19]的研究發現約有17%、43%和40%的委內瑞拉兒童的基因型分別與快速、中等和慢乙酰化狀態有關。慢乙?；?、中等乙?；涂煲阴；蛐蛡€體之間藥代動力學(phararmacokinetics，PK)參數差異有統計學意義，而在快速和中等乙酰化代謝狀態的兒童中觀察到PK參數差異沒有統計學意義。南印度的一項研究表明，2 h INH的血藥濃度在慢、中間和快乙酰化代謝中差異有統計學意義(P=0.021)，其峰濃度(Cmax)分別為11.9、10.0和6.9 μg/ml[20]。 一項基于基因位點指導的INH個體化給藥使更多患者達到了有效治療劑量[21]。

二、藥物基因組學與利福霉素類藥物的代謝

以RFP為代表的利福霉素類抗生素是大環內酯類抗生素，是重要的一線藥抗結核藥物之一，在體外和體內條件下對MTB呈現濃度依賴的殺傷活性；除RFP外，常見的利福霉素還包括利福布汀(rifabutin)、利福噴丁(rifapentine)和利福定(rifadin)等[22-23]。

轉運蛋白對利福霉素在人體中的轉運和代謝中起著重要作用。RFP是由三磷酸腺苷結合盒式結構轉運蛋白超家族成員B1(ATP-binding cassette subfamily B member 1，ABCB1)基因編碼的P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)和由SLCO1B1(solute carrier organic anion transporter family member 1B1)基因編碼的有機陰離子轉運肽1B1(organic anion transporter polypeptide 1B1，OATP1B1)的底物[4]。此外，催化RFP進行脫乙?；x的羧酸酯酶2(carboxylesterase，CES2)、能夠轉錄調節藥物轉運體的孕烷X受體(nuclear receptor subfamily 1 group I member 2，NR1I2)和組成性雄激素受體(Ig-like cell adhesion molecule，CXADR)也被認為可能參與了RFP在體內的代謝。

(一)SLCO1B1基因多態性與利福霉素類藥物

SLCO1B1基因的rs4149032多態性位點：Weiner 等[4]開展的一項來自北美、非洲和西班牙的包括72例成人肺結核患者的藥代動力學研究探討了接受標準治療劑量的TB患者體內的RFP代謝差異性與ABCB1 c.3435C>T、SLCO1B1 c.11187G>A、SLCO1B1 c.388A>G、SLCO1B1 c.463C>T、SLCO1B1 521T>C、SLCO1B1 c.1463G>C和SLCO1B3 c.334T>G基因多態性之間的關系。該項研究首次報道了RFP代謝與SLCO1B1 rs4149032(c.463 C>T)基因多態性之間存在相關性。該研究比較了TB患者和健康受試者之間，不同地區間及不同種族之間在RFP藥代動力學的差異，結果顯示SLCO1B1基因多態性對RFP生物利用度有顯著影響，SLCO1B1 rs4149032 CT雜合變異基因型比CC野生基因型低36%(29.8，P=0.001)。Chigutsa等[5]對南非TB患者進行的一項研究進一步發現：SLCO1B1基因rs4149032 T等位基因在非洲黑人中頻率較高，攜帶該稀有等位基因的雜合和純合基因型個體對RFP的生物利用率相對野生基因型個體分別降低了18%和28%。模擬數據顯示，當攜帶有稀有等位基因的TB患者所使用的每日RFP劑量增加150 mg(增加原劑量的30%)后，其血漿RFP水平能夠與野生基因型個體相似，并能夠使Cmax低于8 mg/L的患者比例從63%降至31%。這項研究表明，有必要對SLCO1B1 rs4149032 A等位基因攜帶患者增加RFP給藥劑量。與此不同，一項來自坦桑尼亞的研究[24](rs4149032)和一項來自南印度的研究[25]均沒有觀察到SLCO1B1基因型(rs11045819、rs4149032和rs4149033)能夠影響RFP的代謝。根據千人基因組計劃的數據，rs4149032稀有等位基因在中國漢族人群(HAPMAP-CHB)中的頻率為36.6%，略高于非洲人群。因此，有必要在中國人群中探討SLCO1B1 rs4149032多態性在影響RFP血漿濃度及其對TB治療結局的影響。

(二)CES2基因多態性與利福霉素類藥物

CES2對RFP進行脫乙?；磻纬?5-脫乙酰RFP，CES2基因多態性能夠顯著影響RFP的血漿濃度。 Song等[26]對35例接受一線抗結核藥物治療的肺結核患者測定RFP和25-脫乙酰RFP的血漿濃度，并采用覆蓋全部12個外顯子、內含子和啟動子區域的CES2基因的PCR測序方法探討了CES2基因變異與RFP代謝的關系；同時，進行雙熒光素酶報告基因檢測以評估啟動子區域的變異是否影響該基因的轉錄。結果顯示三種高度連鎖的變異(c.-2263A>G，c.269-965A>G和c.1612-136G>A)和c.1872*302_304delGAA的基因型與血漿RFP濃度顯著相關。RFP平均血漿濃度隨著3個連鎖變異的突變等位基因的攜帶個數增多而顯著增加，而隨著c.1872*302_304delGAA突變型等位基因數量的增加而減少；并且啟動子區域的c.-2263A>G可能通過影響CES2基因表達改變RFP代謝。

(三)ABCB1、NR1I2和CXADR基因多態性與利福霉素類藥物

Weiner等[4]開展的一項研究中，同時觀察了ABCB1基因多態性在北美、西班牙和非洲不同地區成人肺結核患者中的作用；然而，該研究未明確其基因變異與RFP代謝的相關性。此外，Chigutsa等[5]對南非TB患者進行的一項研究也未發現ABCB1多態性與RFP代謝的相關性，由于RFP既是ABCB1基因編碼的P糖蛋白的底物又可被RFP誘導，因此可能需要更多的研究來明確其對藥物轉運和細胞內積累的影響。此外，Chigutsa 等[5]也沒有發現NR1I2和CXADR多態性對RMP 代謝有任何顯著影響。

三、藥物基因組學與乙胺丁醇

目前，一部分藥物基因組學研究關注了一線抗結核藥物EMB。2016年，Fatiguso 等[27]對ABCB1、OATP1B1、CXADR、維生素D受體(VDR)及細胞色素P450家族(CYP24A1和CYP27B1)基因的SNPs和EMB血漿和細胞內濃度相關性的研究發現ABCB1、CYP24A1和VDR基因的SNPs與血漿與細胞內EMB濃度之間有相關性，但尚需要在多種族和大樣本中進一步驗證。

四、 藥物基因組學在其他抗結核藥物代謝中的研究

目前，隨著MTB對一線抗結核藥物耐藥率的增高，非一線抗結核藥物在TB治療中的應用呈現增多的趨勢, 對這些藥物進行藥物基因組學研究有助于指導臨床合理用藥。有研究已經報道了ABCB1、UGT1A和SLCO1B1基因多態性對莫西沙星藥代動力學的影響： Naidoo等[28]的研究顯示，轉運蛋白基因UGT1A的rs8175347TA5/6基因型相比TA6/6、 6/7、 7/7 和7/8基因型能夠降低莫西沙星20.6% 的藥物清除率，rs3755319位點的AC和AA基因型相比CC基因型能夠降低莫西沙星11.6%的藥物清除率；編碼轉運蛋白P-gp的編碼基因ABCB1的rs2032582多態性與莫西沙星藥代動力學參數的變化顯著相關，稀有基因型可使莫西沙星生物利用度降低40%。而Weiner等[29]發現，ABCB1 基因中的rs1045642多態性位點不影響個體對莫西沙星的代謝能力，并由此認為P-gp似乎不是莫西沙星代謝的主要決定因素。Weiner 等[30]發現，SLCO1B1的rs4149015AG稀有基因型相對GG野生基因型能顯著增加莫西沙星0～24 h的藥時曲線下面積(AUC0～24)和最大清除率。然而，遺傳變異對莫西沙星藥代動力學的相關性需要更多的研究數據，尤其是中國人群中研究數據的支持。

藥物基因組學與抗結核藥物致肝損傷

目前，INH是公認的導致TB治療中發生肝損傷(anti-TB drugs induced liver injury, ATDILI)的主要抗結核藥物，NAT2對INH消除速率的降低是導致INH毒性旁路代謝產物增高引發肝損傷的主要原因。INH在常規劑量時不良反應較少：肝毒性是TB治療中最常見和最嚴重的不良反應，另一種不良事件是周圍神經病，通常在高劑量時發生，特別是在慢乙酰化代謝個體中；這些不良反應與患者INH的毒性代謝物乙酰肼的清除能力較低有關并可通過吡哆醇合并給藥進行預防[31-32]。慢乙酰化更容易發生INH藥物誘導的肝損傷[33-34]及周圍神經病[35]，而快乙酰化應用標準劑量療效較差[36]，可能需要調整劑量到目前推薦劑量的1.5倍[37]。 Wang等[38]針對來自包括474例患者和1446例對照在內的14項研究的薈萃分析顯示，NAT2慢乙酰化代謝與抗結核藥物引起的肝毒性風險之間存在顯著相關性。一項基因型指導的隨機對照試驗研究了172例日本肺結核患者的治療失敗率和INH引起的肝損傷[36]：基因型指導劑量組的患者根據其乙?；癄顟B分別接受2.5、5.0和7.5 mg/kg INH，而標準劑量組分別接受約5 mg/kg。 標準治療組中有78%的慢乙?；x個體發生肝損傷，而采用基因型指導劑量組的慢乙?；x個體均未經歷肝損傷或早期治療失敗。

此外，細胞色素氧化酶P450(cytochrome P450 oxidase, CYP2E1)作為Ⅰ相代謝酶、谷胱甘肽S-轉移酶(glutathione S-transferase, GST)作為Ⅱ相解毒酶，以及SLCO1B1和ABCB1分別作為重要的肝臟攝取和外排轉運體，其基因多態性與ATDILT易感之間的相關性也被探討，盡管尚未明確[9,39]。

2014年Singla 等[9]針對ATDILI的病例-對照研究表明，CYP2E1基因的雜合基因型′c1c2′是增加ATDILI風險的重要因素?！鋍2′等位基因缺失可被認為是女性對抗ATDILT 的保護因子。在男性中，“c1c2”等位基因的存在被認為是ATDILI風險增加的原因。2011年向陽等[40]采用Meta分析的方法,對國內外公開發表的有關CYP2E1基因多態性與ATDILI易感性的關系的研究文獻進行再分析，納入國內外研究文獻5篇，累計肝損傷組194例，對照組639例；發現CYP2E1c1/c1基因型與ATDILT易感性關系之間的合并OR值為1.86(95%CI=0.95～3.66)，排除1篇研究對象為兒童的文獻，合并OR值為2.22(95%CI=1.51～3.26)。因此認為，盡管ATDILI的易感性與CYP2E1基因多態性沒有相關性，但CYP2E1c1/c1基因型TB患者發生肝損害的危險性可能會增加。最近，武鑫等[41]納入2000年1月1日至2016年10月31日研究中國人群CYP2E1基因多態性與ATDILI風險關系的8篇文獻進行了Meta分析，結果顯示CYP2E1c1/c1與ATDILI風險相關(OR=1.32；95%CI=0.93～1.89)； NAT2慢乙酰化表型與ATDILI風險相關(OR=2.57；95%CI=1.77～3.71)；NAT2慢乙?；硇吐摵螩YP2E1 c1/c1與ATDILI相關(OR=3.53；95%CI=2.05～6.07)。最終得出結論：中國人群中NAT2慢乙酰化表型可以增加ATDILI的發生風險，雖然CYP2E1c1/c1與ATDILT之間關系無統計學意義，但當其與NAT2慢乙?；硇屯瑫r存在時更易導致ATDILI的發生。

2014年Singla 等[9]研究發現，GSTM1和GSTT1雙重失活基因型與ATDILT發生有關。此外，Li 等[42]通過2012年10月以前發布的12項針對GSTM1(包括951例ATDILI病例，1922例對照)和13項針對GSTT1(847例ATDILI患者，1811例對照)的病例-對照研究顯示，GSTM1無效基因型增加了ATDILI風險(OR=1.36；95%CI=1.04～1.79)相關，但GSTT1多態性與ATDILI的風險未見相關(OR=0.98；95%CI=0.82～1.18)。2011年朱冬林等[43]應用多重PCR技術檢測抗結核藥物治療后發生肝損傷的228例TB患者及300例未發生肝損傷的TB患者的GSTM1和GSTT1基因多態性。其結果顯示，病例組與對照組GSTM1基因缺失型頻率差異無統計學意義，GSTT1基因缺失型頻率差異也無統計學意義。Liu等[44]在平均年齡4.7歲(2個月到14.1歲)的163例兒童TB(20例ATDILI和143例對照)群體中的一項研究顯示，GSTM1和GSTT1基因多態性均與ATDILI的發生差異無顯著相關性。最近，祖麗婭·沙塔爾等[45]采用多重PCR檢測2791例肺結核患者的GSTM1和GSTT1基因多態性與治療2個月時發生ATDILI的相關性，發現GSTM1基因型是ATDILI發生的影響因素，單純具有GSTM1缺失基因型和同時具有GSTM1、GSTT1缺失基因型是ATDILI發生的影響因素。

除外INH導致的肝損傷，尚有研究探討RFP所誘導肝損傷的遺傳學機制。有研究表明，SLCO1B1的兩種常見的非同義突變 rs2306283(c. 388A>G)和rs4149056(c. 521T>C)多態性位點處于部分連鎖不平衡狀態，形成4種重要的單倍型：SLCO1B1 * 1A(無突變等位基因)、SLCO1B1 * 1B(rs2306238/c.388A>G)、SLCO1B1 * 5(rs4149056/c.521T>C)和SLCO1B1*15(包含兩種變異)，隨后的另一研究顯示SLCO1B1 * 15單體型與中國人群中RFP誘導的肝損傷有關，可能在膽汁淤積/混合性損傷中發揮作用[46-47]。

目前，高通量的多候選基因位點[12]和全基因組關聯研究(GWAS)[13]已經被應用到ATDILI易感性的研究中。例如，2016年，Petros等[13]使用Illumina Omni Express Exome芯片對48例抗結核藥物治療所致肝損傷患者和354例無肝損傷對照進行全基因組基因分型(GWAS研究)，鑒定出與埃塞俄比亞患者ATDILI風險相關的遺傳變異。其結果顯示，位于第6號染色體RIPOR2(RHO family interacting cell polarization regulator 2)基因內含子中的SNPrs10946737與ATDILI最為相關(P=4.4×10-6，OR=3.4,95%置信區間=2.2～5.3)。

藥物基因組學與MTB耐藥

目前，國內外對耐藥TB呈現出較多的關注。TB耐藥的主要原因被認為是MTB發生了耐藥突變。而MTB發生突變的原因通常從患者依從性差、耐藥菌株的傳播等角度進行探討，但也有研究提示患者對藥物代謝的個體差異性也是導致耐藥的一個因素[48-49]。

目前藥物基因組學在MTB耐藥領域的研究涉及較少。2012年，Pasipanodya等[49]對13項成人TB的隨機對照研究進行的薈萃分析發現，NAT2快乙?；颊邞肐NH進行抗結核治療的失敗率和MTB的獲得性耐藥率高于NAT2慢乙酰化患者。此外，有兩項研究關注了ABCB1基因多態性對耐藥TB發生的意義，發現ABCB1基因rs2032582A等位基因攜帶表現出增高的抗結核藥物抵抗[50-51]。藥物基因組學在該領域相關研究的開展有助于進一步明確導致TB臨床耐藥的機制。

抗結核藥物基因組學研究的挑戰

通過以上分析，筆者發現，抗結核藥物基因組學研究目前主要從以下三方面入手。第一，從血藥濃度(包括原藥濃度及其各階段代謝產物)的動態變化的角度研究基因組序列與抗結核藥代動力學，這是最為直接的方法。第二，由于藥物毒性反應通常是毒性代謝產物在體內聚集的表現，因此還可以從毒性反應角度入手研究基因組序列與ATDILI等不良反應。第三，在血藥濃度的基礎上結合抗結核治療的療效(患者的癥狀與體征的好轉、治療療程的長短等)進行藥物基因組學研究。

不難發現，抗結核藥物基因組學研究目前仍存在很多值得注意的問題。筆者在文中列舉了同一基因位點變異對藥物代謝的影響在不同研究中所得出的研究結論不一致、同一基因位點在不同人群中與肝毒性的相關性不一致等文獻報道。筆者認為，導致這些不一致性的原因必然是多方面的。藥物的吸收、分布和代謝具有十分復雜的調控機制，眾多基因位點必然協同發揮調控作用，不同人群間具有的遺傳異質性，同時，年齡、性別和疾病狀態也能夠參與調控。由于不同研究所納入的研究對照存在民族、地域、年齡和疾病輕重等眾多差異性，且所選取的檢測基因位點和實驗方法也不盡相同，因此研究者應該針對遺傳背景較為一致的目的人群，在具有相似遺傳背景且臨床資料翔實的大樣本中進行相關研究，并對基因位點間的交互作用進行合并分析。

盡管一些研究認為根據基因型調整用藥具有很好的應用價值[21, 36, 52]，由于不同種族具有遺傳差異性，不同種族之間的給藥劑量模型不能直接照搬。當嘗試給出個體化用藥公式時，年齡、體質量、肝功能、腎功能、合并用藥等變量也應作為參數進行優化?？紤]到存在大量基因和眾多位點協同發揮作用，因此如何有效納入和進行交互，還依賴于大數據和智能算法的運用。

目前，藥物基因組學INH和RFP等主要的一線抗結核藥物中的研究數據較多，而在其他抗結核藥物代謝中的研究相對較少[53-54]。非一線抗結核藥物在藥物代謝、藥物不良反應方面同樣面臨挑戰，例如線粒體DNA的12S rRNA基因A1555G或C1494T這兩個稀有等位基因位點是氨基糖苷類抗生素治療耐藥結核病時引發感音神經性耳聾的罪魁禍首[55]。此外，在抗結核藥物的研發領域，許多潛在抗結核藥物已經陸續進入了臨床試驗階段：例如唑烷酮類、咪唑并吡啶、乙二胺、苯并噻嗪酮、硝基咪、高鐵霉素、亞甲基吩嗪等藥物已經進入Ⅰ期或Ⅱ期臨床研究[56]?？梢?，伴隨諸多新藥在TB治療中的應用，抗結核藥物基因組學的挑戰還將持續存在。