未成熟血小板的性能評(píng)價(jià)及在血小板減少性疾病中的應(yīng)用

邱 凱，劉志偉，黃麗春，孫德華

(南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院檢驗(yàn)科,廣州 510515)

未成熟血小板(IPF)是骨髓巨核細(xì)胞新近釋放入外周血的血小板，不含核或DNA成分，卻含有少量的mRNA和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，保留了合成少量蛋白質(zhì)的能力，它是血循環(huán)中最年輕的血小板。IPF體現(xiàn)了骨髓巨核細(xì)胞的血小板生成狀態(tài)，能反映骨髓的血小板生成能力。Sysmex XN-20全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀在檢測(cè)全血時(shí)PLT-F通道可檢測(cè)出未成熟血小板分?jǐn)?shù)(IPF%)和未成熟血小板絕對(duì)值(IPF#),本研究對(duì)其進(jìn)行性能驗(yàn)證和建立參考區(qū)間，并探討其在血小板減少性疾病中的臨床應(yīng)用價(jià)值?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料

1.1.1健康對(duì)照組 2016年5月6日至8日對(duì)廣州市240例健康成人的標(biāo)本進(jìn)行檢查，年齡18～35歲，其中男120例、中位年齡29歲；女120例、中位年齡28歲；體檢正常(體檢內(nèi)容包括血常規(guī)、尿常規(guī)、肝腎功能、血糖、血脂、X線胸片、B超、心電圖等)。

1.1.2疾病組 選擇選取2016年3-6月南方醫(yī)院血液科和小兒科門診及住院患者111例，其中特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)組24例、再生障礙性貧血(AA)組21例、急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)組25例、急性非淋巴細(xì)胞白血病(AML)組28例、骨髓增生異常綜合征(MDS)組13例。ITP組、AA組均為初診尚未治療的患者，全部病例診斷符合血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集 采集所有研究對(duì)象靜脈血，乙二胺四乙酸二鉀抗凝，4 h以內(nèi)完成檢測(cè)。檢測(cè)所有研究對(duì)象的IPF%和IPF#。

1.2.2儀器與試劑 Sysmex XN-20血細(xì)胞分析儀及原廠配套試劑(日本Sysmex公司)。試驗(yàn)前用Sysmex XN CAL PF對(duì)PLT-F進(jìn)行校準(zhǔn)。試驗(yàn)中按儀器操作程序進(jìn)行檢測(cè)調(diào)試，配套e-check高、中、低值質(zhì)控物進(jìn)行測(cè)試，所有分析用參數(shù)結(jié)果均在要求范圍內(nèi)。

1.2.4建立參考區(qū)間 對(duì)240例健康成人的標(biāo)本結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析計(jì)算參考區(qū)間。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

1.3.1數(shù)據(jù)極值的處理 按照NCCLS C28-A2[3]文件的D/R規(guī)則判斷極值是否為同質(zhì)個(gè)體。D=全部數(shù)據(jù)最大(小)-臨近最大(小)值，R=全部數(shù)據(jù)最大值-全部數(shù)據(jù)最小值。若D/R<1/3 則保留極值，證明來源于同質(zhì)個(gè)體，若D/R>1/3則去除極值，以同樣方法再對(duì)臨近極值進(jìn)行處理。若有離群點(diǎn)被剔除后，應(yīng)即將其他數(shù)據(jù)補(bǔ)上。

2 結(jié) 果

2.1Sysmex XN-20檢測(cè)性能評(píng)價(jià)分析

2.1.1精密度 批內(nèi)精密度結(jié)果見表1，批間精密度IPF%的CV值為1.8%、IPF#的CV值為3.7%，批內(nèi)及批間CV均小于5%。

表1 Sysmex XN-20檢測(cè)IPF的批內(nèi)精密度比較

2.1.2穩(wěn)定性 正常值IPF%和IPF#在24 h內(nèi)CV為8.4%、8.8%,高值IPF%和IPF#在24 h內(nèi)CV為4.4%、4.5%，見圖1。

圖1 IPF穩(wěn)定性

2.1.3攜帶污染率 IPF%攜帶污染率為0.16%,IPF#攜帶污染率為0.27%。

2.1.4線性范圍 因IPF%經(jīng)稀釋后數(shù)值不變，因此未做線性檢測(cè)。由圖2可知斜率a值在1.00±0.05范圍內(nèi),R2>0.975,IPF#在(0～94.8)×109/L成線性。

圖2 IPF#線性范圍

2.1.5相關(guān)性分析 應(yīng)用Sysmex XN-20與Sysmex XE-5000檢測(cè)IPF%的R2=0.351,P>0.05;兩種儀器IPF#的R2=0.321,P>0.05,二者無相關(guān)性。

2.2參考區(qū)間 經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)IPF%和IPF#240例健康者數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布(P<0.05)，故用百分位數(shù)值(95%)確定參考范圍,男女組經(jīng)K-W檢驗(yàn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，合并為一組(240例)。參考范圍IPF%:0.9%～4.5%，IPF#:(3.7～9.7)×109/L。

2.3各組血液疾病檢測(cè)結(jié)果比較 ITP組、MDS組的IPF%與健康對(duì)照組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，AA、ALL、AML組的IPF%與健康對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。ITP組的IPF#與健康對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，AA、ALL、AML組的IPF#與健康對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組疾病IPF檢測(cè)結(jié)果比較[M(P2.5～P97.5)]

注：與健康對(duì)照組比較，*P<0.05

2.4ITP組與健康對(duì)照組繪制IPF%的ROC曲線及臨界值 ITP組與健康對(duì)照組IPF%曲線下面積為1，與A=0.5相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果中各可能切點(diǎn)的靈敏度和特異度，計(jì)算約登指數(shù)。以約登指數(shù)最大的切點(diǎn)為臨界點(diǎn)，確定IPF%最佳臨界值為11.6%。該點(diǎn)靈敏度100%，特異度100%，約登指數(shù)1。見圖3。

圖3 ITP組與健康對(duì)照組IPF%的ROC曲線

3 討 論

Sysmex XN-20全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀PLT-F通道是利用熒光色素給血小板染色，采用流式細(xì)胞測(cè)量法(FCM)根據(jù)前向散射光和熒光強(qiáng)度的差異，明確地區(qū)別血小板和其他的血細(xì)胞。根據(jù)檢測(cè)數(shù)據(jù)繪制出二維散點(diǎn)圖，將熒光強(qiáng)度較強(qiáng)的區(qū)域劃分為IPF。通過上述試驗(yàn)結(jié)果可見該儀器檢測(cè)IPF精密度高，穩(wěn)定性好，攜帶污染率極低，線性范圍寬廣,可以滿足臨床檢測(cè)要求。干細(xì)胞移植后為了預(yù)防發(fā)生嚴(yán)重出血并發(fā)癥，會(huì)進(jìn)行預(yù)防性的血小板輸注，但血小板濃縮制劑的使用期限為采血后72 h，為此必須事前預(yù)約,供給量也非常少，成本較高給患者帶來負(fù)擔(dān)的同時(shí)還會(huì)帶來不良反應(yīng)。通過監(jiān)測(cè)IPF，根據(jù)IPF的一過性增加[4]可預(yù)測(cè)血小板恢復(fù),避免了血小板輸血。在腫瘤化療患者，化療停藥后骨髓造血功能恢復(fù)，IPF增加早于血小板數(shù)量的增加[5],監(jiān)測(cè)IPF可了解腫瘤患者骨髓恢復(fù)的情況，指導(dǎo)臨床用藥及腫瘤治療中化療時(shí)機(jī)的選擇。

Sysmex XN-20與XE-5000的IPF%及IPF#檢測(cè)結(jié)果無相關(guān)性，由于當(dāng)前檢測(cè)IPF沒有參考方法，因此分析兩種型號(hào)儀器檢測(cè)結(jié)果的差異原因有兩點(diǎn)：(1)熒光染料的改變，PLT-F的熒光染料以噁嗪為主，可以有效去除白細(xì)胞碎片[6]、紅細(xì)胞碎片、小紅細(xì)胞的干擾；(2)計(jì)算機(jī)分析方式的改變，避免標(biāo)本中存在的微小血小板漏檢。因此與XE-5000相比，Sysmex XN-20全自動(dòng)血細(xì)胞分析采用血小板特異性熒光染料相對(duì)可以得到更精確的IPF。

本研究應(yīng)用Sysmex XN-20全自動(dòng)血液分析儀對(duì)240例健康成人進(jìn)行血細(xì)胞分析，得出95%參考范圍為IPF%:0.9%～4.5%;IPF#:(3.7～9.7)×109/L。初診為ITP的患者IPF%明顯高于健康對(duì)照組[7],由于ITP患者血小板相關(guān)自身抗體與血小板結(jié)合導(dǎo)致單核-巨噬系統(tǒng)對(duì)血小板吞噬、破壞增加、壽命縮短，外周血中血小板破壞過多及骨髓巨核細(xì)胞增生相關(guān)聯(lián)，導(dǎo)致更多新生的血小板釋放入外周血使IPF%升高[8]。初診為AA的患者IPF#明顯低于健康對(duì)照組，AA是由多種原因引起的骨髓造血功能衰竭的一組綜合病癥，骨髓中的巨核細(xì)胞減少，血小板生成出現(xiàn)障礙，新生血小板減少，與ITP不同，此結(jié)果表明IPF%與IPF#可以鑒別生成障礙還是破壞過多引起的血小板計(jì)數(shù)減少[9]。從ROC曲線得到IPF%最佳臨界值為11.6%。該點(diǎn)靈敏度100%，特異度100%，以此對(duì)ITP與健康人區(qū)分的準(zhǔn)確性最高。因此IPF可以用于ITP臨床診斷以及ITP和AA鑒別診斷。與健康對(duì)照組比較，MDS的IPF%差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，從SUGIMORI等[10]研究可知高IPF的病例中100%都有染色體異常，預(yù)后不良的5號(hào)和7號(hào)染色體異常出現(xiàn)概率較大，可以用于治療、預(yù)測(cè)的輔助檢驗(yàn)，IPF的高低可以區(qū)分預(yù)后好壞。

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