量子點與蛋白質相互作用熱力學

顏 稔 賴 璐 許子強 蔣風雷,* 劉 義,*

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量子點與蛋白質相互作用熱力學

顏 稔1賴 璐2許子強3蔣風雷1,*劉 義1,*

(1武漢大學化學與分子科學學院，武漢430072；2長江大學化學與環境工程學院，湖北荊州434023；3湖北大學材料科學與工程學院，武漢430062)

量子點(QDs)具有寬激發窄發射、量子產率高、發射波長可調和抗光漂白等優異的光學性質，因而在生物醫學成像與示蹤、生物傳感等方面有著廣泛的應用前景。量子點進入生命體系后，首先會遇到蛋白質，量子點與蛋白質之間發生相互作用后，蛋白質的結構和功能會因此發生變化，量子點的性能及應用也會發生改變。研究量子點與蛋白質的相互作用規律，可以為量子點的精細設計、高效應用以及生物安全性評價提供理論依據。本文在總結國內外相關文獻和本課題組工作的基礎上，介紹了量子點與蛋白質相互作用的熱力學方法；重點從熱力學角度揭示量子點與蛋白質相互作用的機制。

量子點；蛋白質；相互作用；熱力學；熒光猝滅

1 引言

量子點(QDs)，又可稱之為半導體納米晶，通常是由II-VI、III-V或IV-VI族元素組成，粒徑一般介于1－10 nm。當半導體的尺寸小于或等于激子波爾半徑時，會產生明顯的量子限域效應，連續的能帶變成分立的能級結構，因此具有特殊的光學和電學特性1。與傳統的有機熒光染料相比，量子點具有熒光發射可調、發射光譜窄而對稱、吸收光譜寬以及光穩定性好等獨特的光學特性。因此，量子點被廣泛地應用于生物研究和臨床醫學等方面，如體內外成像、腫瘤的檢測與治療、免疫組織化學檢測、藥物運輸與治療、生物傳感、單顆粒示蹤等2?4。量子點的應用對生物醫學研究產生了深遠的影響，但是量子點通常含有重金屬元素, 具有特有的尺寸效應，其應用于生物體系所帶來的潛在風險也引起了人們越來越多的關注5?7。

為了解量子點的生物安全性，人們從生物大分子8,9、細胞器10、細胞11?14、動物15等不同生命層次11,16，研究了量子點的致毒機制。蛋白質是生物體內重要的一類生物大分子，是細胞原生質的主要成分，與核酸一起共同構成了生命體的物質基礎。當分散在生物流體(如血液)中時，量子點表面可能會吸附蛋白質或其它生物大分子，或者發生聚集生成不同大小的聚集體17。因此，研究量子點與蛋白質的相互作用顯得非常必要。

本文主要從研究方法、研究對象、實驗結果以及研究展望等方面，對量子點與蛋白質相互作用熱力學進行了綜述，以期能較為全面地反映量子點與蛋白質相互作用的研究現狀。

2 量子點與蛋白質相互作用研究方法

目前，已報道用于研究量子點與蛋白質相互作用的量子點，包括CdTe、CdSe、CdTe:Zn、InP/ZnS、CdSe/ZnS、ZnSe、Zn(1?)FeS、CdS等。其中，鎘系量子點量子產率高、合成方法較為成熟，在細胞成像18、活體成像19、細胞示蹤20、靶向分子成像21領域應用前景廣闊。因此，有關鎘系量子點與蛋白質的相互作用的研究最為深入。

血清白蛋白是血漿中含量最豐富的蛋白質，在生物體內有著重要的生理功能22,23，不僅可以維持血漿正常的滲透壓24，在體內還承擔著脂肪酸和藥物等物質的運輸功能25。人血清白蛋白(HSA)和牛血清白蛋白(BSA)是兩種主要的水溶性血清白蛋白。HSA有585個氨基酸殘基26，BSA有583個氨基酸殘基27。兩者結構同源，因此BSA和HSA經常被用作模型蛋白質來進行研究。此外，免疫球蛋白也被報道過28。免疫球蛋白指具有抗體活性的動物蛋白，主要存在于血漿中，也見于其他體液、組織和一些分泌液中29。

2.1 等溫滴定量熱(ITC)

等溫滴定微量熱法是直接檢測相互作用過程的熱效應，從而是獲得相互作用過程中的結合常數、焓變、熵變以及結合計量比等熱力學參數的一種實驗方法。將量子點滴定至裝有蛋白質的樣品池中，通過等溫滴定量熱計，可實時監測相互作用產生的熱量，再用等溫熱力學方程擬合，就可以得到相關的作用熱力學參數。該方法不需要做任何的化學修飾或固定30。Cedervall31最早提出用ITC研究蛋白質與納米顆粒的結合常數和計量比，并發現納米顆粒與HSA的結合計量比與納米顆粒的粒徑和疏水性有關。

量子點與蛋白質之間的作用力主要為靜電力、疏水作用力、范德華力、氫鍵等32?34。Ross等35于1981年提出了生物大分子與小分子相互作用過程中，如何由熱力學參數判斷作用力的規律。即：當Δ> 0、Δ> 0時，兩者間為典型的疏水作用力；Δ< 0、Δ< 0時，主要作用力為氫鍵和范德華力(其中之一，或兩者均有)；Δ≈ 0或較小、Δ> 0時，為靜電作用力，其中，若Δ< 0、Δ> 0，為特異性靜電作用。通過ITC獲取上述熱力學參數，可以據此推斷量子點與蛋白質之間作用的驅動力。采用ITC方法，獲取的量子點與蛋白質之間的相互作用熱力學參數如表136?40所示。

如表1所示，Xue等40研究巰基乙酸(TGA)修飾的CdTe量子點與硫酸魚精蛋白(protamine sulfate)相互作用的機理時，采用ITC法求得CdTe量子點與硫酸魚精蛋白相互作用的Δ< 0、Δ> 0，判斷出兩者之間的作用力主要為靜電作用力。

ITC方法雖然簡單易行，但是對實驗要求比較高。如要求量子點濃度較高，而且要求量子點與蛋白質之間的結合比較強。如Yang等37用ITC研究熒光發射在515、540、555、572 nm的四種CdTe量子點與HSA相互作用時，QDs-515 (熒光發射在515 nm)和QDs-540 (熒光發射在540 nm)的產熱曲線無法擬合，原因就在于QDs-515和QDs-540粒徑較小，與蛋白質的結合能力比較弱。

2.2 熒光光譜法

血清白蛋白含有三種具有發熒光的氨基酸殘基(色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)。在280 nm激發，蛋白質的熒光主要源于色氨酸殘基41,42，苯丙氨酸在此條件下激發產生的熒光可以忽略43。色氨酸殘基產生的熒光對微環境的變化十分敏感，因此常常選擇色氨酸殘基研究蛋白質與小分子的相互作用44。用熒光光譜法研究量子點與蛋白質相互作用是基于熒光猝滅法。量子點對蛋白質的熒光有一定的猝滅作用，猝滅的機理可分為兩種：動態猝滅和靜態猝滅。動態猝滅依賴于擴散，因此猝滅常數sv會隨著溫度的升高而增大；而靜態猝滅則是由于生成了復合物，溫度升高會導致復合物的穩定性降低，因而猝滅常數sv隨著溫度的升高而降低45。另一方面，在動態猝滅過程中，猝滅劑與激發態的熒光基團發生了碰撞，這一過程會導致熒光壽命的變化。而復合物的生成并不影響蛋白質的熒光壽命46。因此，考察猝滅劑對熒光基團的熒光壽命的影響，也可用于區分靜態猝滅和動態猝滅47。對于靜態猝滅，可以用經典的Stern-Volmer方程描述48：

表1 ITC法研究量子點與蛋白質相互作用熱力學參數(298 K)

NAC:N-acetyl-L-cystein, GSH: Glutataione:,TGA: mercaptoacetic acid,:binding constant

0是未加入量子點時蛋白質的熒光強度，是加入量子點后蛋白質的熒光強度；q是猝滅速率常數；0是蛋白質分子的熒光壽命；sv為Stern-Volmer猝滅常數；[]是猝滅劑的濃度。根據公式(1)，用0/對[]作圖，由直線的斜率可以求得猝滅常數。Yang等37研究谷胱甘肽(GSH)-CdTe量子點與人血清白蛋白相互作用時，分別采用熒光猝滅法和測量熒光壽命的方法，均證明GSH-CdTe量子點對人血清白蛋白的熒光猝滅機理是靜態猝滅。對于靜態猝滅，通常用修正的Stern-Volmer方程計算結合常數a49，

圖1 不同配體修飾的CdTe量子點存在時HSA的熒光光譜圖51

(a) MPA(3-Mercaptopropionic acid) -CdTe QDs, (b) NAC(N-acetyl-L-cystein)-CdTe QDs, (c) GSH(Glutataione)-CdTe QDs, (d) CA(2-AMINOETHANETHIOL)-CdTe QDs) at 298 K.(HSA) = 1 × 10?6mol·L?1. The insets correspond to the Stern-Volmer plot.

式(2)中，Δ是未加入猝滅劑(量子點)和猝滅劑(量子點)濃度為[]時，人血清蛋白(HSA)熒光強度的差值；[]為猝滅劑濃度；a為熒光物質(蛋白)可接近猝滅劑的部分(分數)；a為有效猝滅常數。對靜態猝滅而言，a可視作為結合常數。0/Δ對[]?1作圖，應得一直線，斜率為1/aa，截距為1/a。截距除以斜率即為結合常數a。

將不同溫度下的結合常數代入范特霍夫方程(3)中，

以ln對1/作圖，應得一條直線，斜率即為?Δ/，由此可以算出蛋白質與量子點相互作用的焓變，由截距可求熵變。由吉布斯自由能公式：

可以求出蛋白質與量子點相互作用的熱力學參數。

采用熒光光譜方法，獲取的量子點與蛋白質之間的相互作用熱力學參數如表250–61所示。

Lai等51等采用熒光光譜法研究了不同配體修飾的CdTe量子點與HSA的相互作用(圖1)，發現簡單小分子配體對量子點與蛋白質的結合力影響不大。Tian等52研究CdTe量子點與α-糜蛋白酶(α-chymotrypsin)相互作用時，發現疏水作用力和靜電作用力都存在，D的值比較大，疏水作用力占主導地位。Huang等54研究InP/ZnS量子點與HSA相互作用時，熒光光譜得到的結論：Δ< 0、Δ> 0，判斷兩者間作用力為靜電作用力。為了進一步驗證此結論，作者在0.2 mol?L?1NaCl存在的條件下重復了熒光猝滅的實驗。在NaCl存在的條件下，InP/ZnS量子點與HSA相互作用的猝滅常數和結合常數分別為4.87 × 107L?mol?1和2.80 × 107L?mol?1，比NaCl不存在的條件下顯著降低了(猝滅常數和結合常數分別為5.37 × 107L?mol?1和3.51 × 107L?mol?1)。這一實驗結果再次證實了InP/ZnS量子點與HSA之間存在靜電作用力。Shen等61采用熒光光譜法研究了CdS量子點與人血紅蛋白相互作用，發現此相互作用過程的Δ< 0、Δ> 0，由此判斷兩者間的相互作用力為靜電作用力。

表2 熒光光譜法研究量子點與蛋白質相互作用熱力學參數(298 K)

TAA:thioacetamine, L-cys: 2R)-2-amino-3-[(4-methylphenyl)methylsulfanyl]propanoicacid, ME: 2-mercaptoethanol

2.3 電化學方法

循環伏安法(CV)可以檢測體系中電化學性質的變化。量子點與蛋白質發生相互作用時，循環伏安曲線的峰電流會隨之發生變化。例如：Xu等62用CV研究CdTe量子點與HSA作用時，將HSA修飾在電極上，利用K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6做氧化還原對，CdTe量子點與電極上的HSA結合會降低K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6的峰電流。從循環伏安曲線上(圖2)，得到不同濃度的量子點存在的條件下，對應的峰值。根據Langmuir方程(5)：

in 5.0 × 10?3mol?L?1Fe[(CN)6]3?/4?, pH 7.20 PBS buffer solution, 0.1 mol?L?1KCl supporting electrolyte in the potential range 0.00 and 0.50 V at a sweep rate of 50.0 mV?s?1in the presence of QDs with different size distribution.The concentrations of QDs are from 0 to 96 × 10?9mol·L-1at an interval of 1.2 × 10?9mol·L?1.

電化學交流阻抗法(ESI)是基于電荷轉移電阻的變化，確定量子點與蛋白質相互作用的結合常數。根據電化學交流阻抗譜，建立等效電路，確定等效電路中有關原件的參數值。如Xu等62用此法研究CdTe量子點與HSA作用時，根據電化學交流阻抗譜建立的等效電路，確定Nyquist圖，半圓形的直徑就是電荷轉移電阻ct。增加量子點的濃度時，ct會隨之增加(圖3)。這說明當量子點結合在HSA修飾的電極上，會阻礙電荷的轉移。

圖3 HSA修飾的金電極在CdTe量子點存在時的Nyquist曲線62

in 5.0 × 10?3mol?L?1Fe[(CN)6]3?/4?, pH 7.20 buffer solution, 0.1 mol?L?1KCl supporting electrolyte in th frequency range from 10 to 0.1 Hz in the presence of QDs with different size distribution.The concentrations of QDs are varied from 0 to 9.6 × 10?10mol?L?1at an interval of 1.2 × 10?10－1.2 × 10?9mol?L?1.

從Nyquist圖中可以得到的不同的量子點對應的ct，通過方程：

ct(0)、ct()代表量子點不存在和存在時的電荷轉移電阻。a是量子點與蛋白質的結合常數，是量子點的濃度。ct()對應該是一條直線，斜率即為結合常數。

Xu等62發現用電化學方法求出的結合常數與熒光光譜法求出的差異較大：用CV法求出的結合常數為7.051 × 108L·mol?1，ESI法求得的為1.330 × 109L·mol?1，而熒光光譜法求得的結合常數為1.756 × 107L·mol?1。這可能是因為熒光光譜法是主要考察蛋白質的熒光發色團色氨酸殘基與量子點相互作用，而不是整個蛋白質分子；此外，熒光光譜法考察在溶液中發生的反應，而電化學方法考察固-液相界面發生的反應。因此，不能僅僅使用一種方法研究量子點與蛋白質的相互作用，多種方法的合理運用有助于從多角度闡明作用機理。

圖4 MPA-CdTe與HSA作用的圓二色譜52

(HSA) = 1 × 10?5mol·L?1; 106(QDs)/(mol·L?1): A 0, B 0.5, C 1, D 2; pH = 7.4

2.4 紫外光譜(UV-Vis)

紫外光譜是測定物質在紫外和可見區選擇性吸收而產生的吸收光譜，從而對被測物質進行定性分析。蛋白質的基本結構是α-氨基酸。氨基酸中只有芳香族氨基酸在205?310 nm有吸收。205 nm處一般是肽鍵的→*吸收峰，280 nm是芳香族氨基酸殘基的吸收峰63,64。氨基酸殘基的微環境由蛋白質的構象決定。蛋白質構象發生變化時，微環境會發生變化，吸收光譜也會隨之發生變化，吸光度和譜帶寬度也會發生變化65,66。通過比較量子點與蛋白質結合前后，蛋白質吸收光譜的變化，可以判斷蛋白質的構象是否發生了變化，也能由此判斷量子點猝滅蛋白質的機理。如Kotresh等67發現CdTe量子點會引起BSA吸收峰的下降。由于動態猝滅只影響熒光基團的激發態而不改變吸收光譜，靜態猝滅則是形成基態復合物，因而可以推測，CdTe量子點猝滅蛋白質熒光的機理可能是靜態猝滅。紫外光譜具有簡單、快速、靈活等優點，但是紫外光譜得到的結論必須借助其他表征手段進行佐證。

表3 CdTe量子點對HSA二級結構含量的影響51

2.5 圓二色譜(CD)

蛋白質二級結構的含量，可以通過CD確定68?70。CD可以反映蛋白質的二級結構變化。208和222 nm處的兩個負峰是蛋白質的α-螺旋特征峰71。α-螺旋含量的計算式如下72：

[α-Helix]= [(-MRE208-4000)/(33000?4000)] ×

100% (7)

式中，MRE208是208nm處的殘基的平均摩爾橢圓率，4000是208 nm處無規卷曲和β折疊的殘基平均摩爾橢圓率，33000是208 nm處α螺旋的殘基的平均摩爾橢圓率。

MRE208= intensity of CD at 208nm/10(8)

(8)式中，是蛋白質的摩爾濃度，是CD樣品池厚度(cm)，是蛋白質的氨基酸殘基目。

例如，Lai等51研究不同配體修飾的CdTe量子點與蛋白質相互作用時，發現隨著量子點的加入，[]208和[]222的強度會降低，這說明蛋白質中的α-螺旋結構含量減少(圖4)。α-螺旋含量下降表明蛋白質的構象發生變化。對比巰基丙酸(MPA)、乙酰半胱氨酸(NAC)和GSH修飾的CdTe量子點，巰基乙胺(CA-CdTe)量子點對人血清白蛋白的α-螺旋含量的影響更大(表3)。這些結果表明量子點表面電荷對蛋白質的構象有不同程度的影響。Wang等59研究GSH、L-Cys(半胱氨酸)、MPA修飾的CdTe量子點與BSA相互作用時，發現GSH修飾的CdTe量子點對BSA構象的影響程度最大。Wang等58認為配體小分子(如GSH、L-Cys)若含有-NH2，能與BSA形成氫鍵。-NH2的含量越高，兩者相互作用力越強。Xiao等50研究不同粒徑的CdTe量子點對蛋白質構象的影響時，發現四種不同粒徑的量子點與蛋白質相互作用后都會使HSA的α-螺旋含量降低。粒徑最大的CdTe量子點(深紅色熒光)使HSA的α-螺旋含量由61.1%下降為37.8%。這些實驗結果表明不同粒徑的CdTe量子點可能會造成HSA構象的變化，而且大粒徑的量子點影響更顯著。Bai等73研究了MSA(巰基丁二酸)和DPA(二甲基半胱胺酸)修飾的CdTe/ZnS量子點與HSA相互作用，發現含有更多羧基的MSA配體對蛋白質構象的影響程度也更大，α螺旋含量由59%下降到45%，DPA修飾的CdTe/ZnS量子點由59%下降到56%(表4)。

表4 DPA-QDs和MSA-QDs對HSA二級結構含量的影響73

2.6 紅外光譜(FT-IR)

紅外光譜法是一種根據分子內部原子間的相對振動和分子轉動等信息來確定物質分子結構和鑒別化合物的分析方法。蛋白質主要包括兩個酰胺帶的吸收：酰胺I帶(1700?1600 cm?1)和酰胺二帶(1500?1550 cm?1)74。酰胺I帶最為敏感，經常用來確定蛋白質構象的變化。如Huang等54研究InP/ZnS對HSA的結構影響時，加入量子點后，HSA酰胺I帶的吸收峰紅移了，C＝O官能團由1642 cm?1紅移到1655 cm?1，N―H官能團由1546 cm?1紅移到1548 cm?1，表明HSA的構象發生了變化。但是，紅外光譜只能檢測蛋白質的構象是否發生了變化，不能獲得蛋白質完整的結構信息。

表5 不同摩爾比的HSA對CdTe量子點水合粒徑的影響51

表6 量子點與蛋白質相互作用研究方法的優缺點

2.7 動態光散射(DLS)

動態光散射是基于膠體粒子的布朗運動來測定顆粒的擴散系數，然后根據Stokes-Einstein公式計算顆粒大小的一種技術。Lai等51研究了加入HSA前后量子點粒徑的變化，發現表面帶負電的MPA、GSH、NAC配體修飾的量子點，與蛋白質作用后，粒徑增加(表5)。對于表面帶正電的CA修飾的CdTe量子點，水合粒徑比帶負電荷的量子點增大了幾十倍，可能是因為蛋白質的加入引起了量子點的聚集。

3 總結及展望

本文在結合國內外研究和本課題組研究的基礎上，介紹了7種研究量子點與蛋白質相互作用的方法。熒光光譜法和ITC是兩種確定熱力學參數的基本方法，通過熱力學參數，可以判斷蛋白質與量子點之間相互作用的驅動力，闡明相互作用的熱力學機制。電化學方法能比較精確測量量子點與蛋白質相互作用的結合常數。它們都可以直接地反映蛋白質構象的變化，CD還可以定量的計算蛋白質α螺旋、β折疊等含量的變化情況。量子點使蛋白質的α螺旋含量降低，將對蛋白質的二級結構和三級結構造成一定影響，進而影響蛋白質的生理功能。DLS可以測量量子點與蛋白質相互作用時粒徑的變化，也能檢測量子點在結合過程中是否發生了聚集。總之，量子點與蛋白質之間的相互作用，對量子點的穩定性和蛋白質的結構可能會產生一定影響。表6總結了量子點與蛋白質相互作用研究方法的優缺點。

大多數量子點與蛋白質的相互作用都是自發的，作用力一般是靜電作用力。量子點與蛋白質的相互作用與量子點、蛋白質的種類有關，也與量子點的表面電荷、粒徑、表面配體化學組成有一定的關系。主要研究結論如下：

1. 量子點表面電荷的影響：Xiao56發現表面帶負電荷的CdTe量子點與HSA的結合能力更強。Lai51和Ashraf77等則發現表面帶正電荷的CdTe量子點與蛋白質相互作用后，會發生聚集現象。

2. 量子點粒徑的影響：Xiao50研究不同粒徑的CdTe量子點與HSA相互作用時發現，粒徑越大的CdTe量子點與HSA的結合越強，對蛋白質的構象的影響程度越大。Yang37，Huang55，Xu62，Xiao等78也有類似結論。

3. 表面配體化學組成的影響：Lai51和Wang58分別研究了不同配體修飾的CdTe量子點與HSA和BSA的相互作用，結果表明量子點與蛋白質的結合常數受量子點配體結構的影響相對較小。

已有文獻報道，量子點與生物大分子相互作用后，會改變量子點的表面性質。這種“改性”后的量子點才是決定其生物效應的關鍵因素。除了本文介紹的幾種研究方法外，凝膠電泳、熒光相關光譜、核磁共振譜、石英晶體微天平等方法，也可用來研究納米材料與蛋白質相互作用。隨著物理表征技術的進一步發展，量子點等納米粒子與生命體系的相互作用特征將得到更好的“時-空”詮釋。全面、準確考察量子點與蛋白質的相互作用及其機制，對量子點的理性設計、高效應用和生物安全性評價具有重要指導意義。

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Thermodynamics of the Interactions between Quantum Dots and Proteins

YAN Ren1LAI Lu2XU Zi-Qiang3JIANG Feng-Lei1,*LIU Yi1,*

(1;2;3)

Quantum dots (QDs) exhibit excellent properties, such as broad absorption, narrow emission , high photoluminescence quantum yields, tunable emission wavelength, and anti-photobleaching. As a result, QDs have important applications in biological imaging, tracking, and sensing. When QDs enter living systems, they first encounter proteins. The interactions between proteins and QDs significantly influence the structures and functions of the proteins, as well as the performance of the QDs in applications. Studies on the interactions between QDs and proteins can provide a theoretical basis for the design, efficient application, and safety evaluation of QDs. Herein we have summarized methods for characterizing thethermodynamics of QD-protein interactions, on the basis of previous work by both our group and others. We also highlight the thermodynamic mechanisms of the QD-protein interactions.

QDs; Protein; Interaction; Thermodynamics; Fluorescence quenching

April 7, 2017;

May 22, 2017;

June 9, 2017.

Corresponding authors. JIANG Feng-Lei, Email: fljiang@whu.edu.cn. LIU Yi, Email: yiliuchem@whu.edu.cn.

10.3866/PKU.WHXB201706096

O642

The project was supported by the National Science Foundation of China (21573168, 21303126, 21473125, 21403017, 21603067) and National Science Fund for Distinguished Young Scholars, China (21225313).

國家自然科學基金(21573168, 21303126, 21473125, 21403017, 21603067)和國家杰出青年科學基金(21225313)資助項目