CAR-NK細胞過繼免疫療法治療腫瘤的研究進展

蔣亞楠，于懷海，孫雨飛，付 強，2

(1濱州醫學院,山東煙臺264003；2北卡羅萊納大學Lineberger腫瘤中心,美國教堂山27514)

0 引言

自然殺傷細胞(natural killer,NK)是固有免疫系統的重要成員,NK細胞和其它血液細胞一樣都是由造血干細胞分化而來,在骨髓中成熟,其成熟程度取決于骨髓的微環境［1］。NK細胞執行殺傷功能時不需要被激活,且無主要組織相容性復合物(major histocompatibility complex,MHC)限制性,可不依賴抗體快速且直接殺傷突變的細胞,具有廣譜的抗腫瘤作用［2］。NK細胞可以利用穿孔蛋白把顆粒酶轉運到靶細胞內部殺傷細胞,也可以通過NK細胞表面的Fas配體與靶細胞表面的Fas相互作用,從而殺傷靶細胞［3］。此外,抗體依賴的細胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)通過 Fc受體CD16觸發NK細胞對抗體結合的靶細胞的脫顆粒作用來殺傷靶細胞［4］。另外,研究表明NK細胞聯合PD-L1抑制劑使小鼠的存活率翻倍［5］,而且NK細胞可以促進樹突狀細胞向腫瘤內部遷移的數量,提高腫瘤細胞對PD-1免疫治療的敏感性［6］。因此,NK細胞在腫瘤的免疫治療中發揮了重要的作用［7］。

腫瘤的生物治療是腫瘤治療的第五代治療模式［8］,而細胞的過繼性免疫療法在腫瘤的綜合治療中發揮著越來越重要的角色。NK細胞的過繼性免疫療法是指在體外激活并誘導培養NK細胞并將其回輸到腫瘤患者體內,從而能夠發揮直接或間接的腫瘤殺傷作用［8］。嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor,CAR)是一種人工改良的合成蛋白,主要是由胞外抗原識別區域、跨膜結構域、連接子和一系列的胞內信號區域構成,可以使效應細胞以不依賴MHC的方式識別腫瘤表面特異性的抗原,激活效應淋巴細胞并靶向殺傷腫瘤細胞［9］。CAR修飾的T淋巴細胞(CAR-T)可以利用CAR直接識別腫瘤特異性抗原,隨即T細胞被激活、增殖,并分泌細胞因子發揮細胞毒性作用,CAR-T細胞對特定的腫瘤抗原表現出了高親和性和高效殺傷作用。但是,CAR-T細胞治療也存在著一些問題,如細胞因子風暴、脫靶效應、對實體瘤治療不敏感、CAR-T細胞的制備周期長以及基因突變的風險等［10－11］。而NK細胞在體內的生存周期短,不會因在體內持續的存在而造成長期的副作用；另外,因CAR-NK細胞的非HLA限制性,可以選用包括干細胞、異體NK細胞和細胞系作為CAR-NK細胞制備的載體；CAR-NK細胞在治療血液系統惡性腫瘤及實體瘤中相比較于CAR-T細胞具有明顯的優勢。

1 CAR-NK細胞的結構

CAR-NK細胞與CAR-T細胞在抗原結合區和跨膜區中的結構基本相同,合適的CAR結構對于激活CAR轉導的細胞非常重要。CAR結構的構建發展歷經三代,從第一代使用含有CD3ζ作為細胞信號結構域到第二代的CD3ζ聯合CD28或4-1BB,以及現在的第三代CD3ζ聯合CD28和4-1BB［12］。一般來說,NK細胞中的第二代CAR較第一代更為活躍。而體外實驗證實,第三代CAR具有更好的靶向特異性和細胞毒性［13］。另外還有根據NK細胞的激活特征,設計出的非典型的CAR構建體,如NKG2D-DAP10-CD3ζ。NKG2D是NK細胞的活化受體,可以激活NK細胞發揮細胞毒性作用,在許多腫瘤細胞上均由NKG2D配體的表達,利用NKG2D取代scFv作為NK細胞胞外抗原識別域,DNAX激活蛋白10(DNAX-associated protein,DAP10)聯合CD3ζ共同組成細胞信號結構域［14］,從而構建 NKG2D-DAP10-CD3ζ這種新穎的CAR結構。在NK細胞中,DAP12相比CD3ζ可以更好地傳遞激活性信號［15］,而DAP10相比CD3ζ的信號激活效率更弱［16］。通過逆轉錄病毒轉導,這種結構可以轉入NK細胞增強其對腫瘤細胞的細胞毒性。對于第二代CAR,重要的共刺激分子4-1BB與CD3ζ作為胞內結構域結合,其顯著增強了CARNK細胞的靶向裂解［17］。然而,最佳NK細胞活化的CAR構建體組合取決于腫瘤類型或靶抗原,這些CAR-NK細胞對多種腫瘤細胞表現出較強的細胞毒性,在骨肉瘤、前列腺癌和橫紋肌肉瘤中觀察到非常好的效果［18－19］。

2 CAR-NK細胞的來源

CAR-NK細胞來源豐富,可以由臍帶血(UCB)、外周血(PB)、誘導多能干細胞(iPCSs)、人胚胎干細胞(hESCs)甚至NK-92細胞系提供［18］。UCB為免疫治療提供了一種異基因的、非自身來源的 NK細胞［20］。研究用含有CD19、白細胞介素15(Interleukin 15,IL-15)和誘導型 caspase-9自殺基因(Induced caspase-9,iC9)的逆轉錄病毒轉染UCB來源的NK細胞,結果表明,轉染后的NK細胞對表達CD19的腫瘤細胞和原發性白血病細胞都表現出了高效的殺傷作用,并且在異種移植Raji淋巴瘤小鼠模型中小鼠的存活率獲得了顯著地延長［21］；IL-15轉染的UCB-NK細胞可進一步改善NK細胞的功能。另外iPSC也可以作為CAR-NK細胞的來源,通過整合NKG2D跨膜結構域改進的CAR可以增強其抗腫瘤的活性,并且在卵巢癌異種移植模型中,iPSC來源的NK細胞與其他來源的NK細胞相比,能夠顯著抑制腫瘤生長并延長小鼠的生存期［22］。NK-92細胞來自一名非霍奇金淋巴瘤患者,其特征為 CD56brightCD16neg/low NKG2A+ 和 KIRnegative(KIR2DL4 除外)［23］。 臨床一期實驗證實了即使使用了高達1010個/m2劑量的NK-92細胞,NK-92細胞的輸注也是安全的。NK-92細胞群是一類細胞系,在良好的培養條件下容易擴增,可用于更廣泛的臨床應用,因此CAR修飾的NK-92細胞可以批量成品生產［24］。一般腫瘤細胞系來源的NK細胞,在輸注之前必須經過照射。而活化的PB-NK細胞表達更廣泛的活化性受體,并且可以不用照射就可以在體內擴增［18］。來源于iPSC或hESC的NK細胞結合了PB-NK和NK-92細胞的優點,它們表現出與PB-NK細胞相似的表型,并且又是自體同源細胞［18］。因此,在使用非病毒基因方法轉染時,來源于hESC或iPSC的NK細胞中的這種CAR結構更容易表達廣泛的活化性受體并且可以不經照射在體內回輸［25］。

3 CAR-NK細胞在腫瘤過繼免疫治療中的優勢

盡管CAR-T細胞在早期達到了治療效果(特別是在惡性血液病腫瘤中),但是大規模臨床應用CAR-T細胞治療可能受到個體化治療的限制和副作用的影響。鑒于這些問題,CAR-NK細胞在免疫治療中表現出了極大的優勢。①安全性：CAR-NK細胞可能比CAR-T細胞更安全。臨床使用NK細胞免疫治療的安全性已在多個臨床領域得到驗證［18］。例如,臨床I/II期試驗顯示,同種異體NK細胞輸注耐受性好,不會導致移植物抗宿主病(Graft-versus-host disease,GVHD)和嚴重的毒性［26］；所以,NK 細胞可以不限于自體細胞來驅動CAR發揮作用。CAR-T細胞治療的主要副作用之一是靶向脫離腫瘤(on-target/off-tumor)的作用。例如,由于T細胞的細胞記憶性和正常成熟B細胞的侵襲,CD19靶向CAR-T細胞可導致嚴重而持久的B細胞缺陷［27］。不同的是,CARNK細胞在體內的存活期短使用壽命有限,幾乎沒有脫靶效應。此外,NK細胞產生的細胞因子的類型與T細胞產生的細胞因子不同［28］；活化的NK細胞通常產生干擾素γ(IFN-γ)和粒細胞巨細胞集落刺激因子(GM-CSF),而CAR-T細胞誘導的細胞因子風暴主要由促炎細胞因子如腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor,TNF-α)、白細胞介素 1(IL-1)和 IL-6等介導［18］。②誘導抗原特異性靶細胞裂解：除了通過CAR特異性殺死靶細胞機制(scFv識別腫瘤相關抗原),NK細胞還可以通過識別激活受體的多種配體殺死腫瘤細胞。當腫瘤細胞上表達應激誘導的配體或在長期治療腫瘤過程中,這些NK細胞的活化性受體才會在免疫系統的介導下識別配體。此外,NK細胞還可以通過FcγRIII(CD16)介導ADCC作用來殺傷腫瘤細胞。因此,CAR-NK細胞可以通過CAR依賴性和NK細胞受體依賴性機制來殺死靶細胞,以消除腫瘤相關抗原陽性的腫瘤細胞或表達NK細胞受體配體的腫瘤細胞。臨床試驗表明,CAR-T細胞不能根除高度異質性的腫瘤細胞,而CAR-NK細胞可以有效地根除長期治療后可能改變其表型的殘留腫瘤細胞。

4 CAR-NK細胞在腫瘤過繼免疫治療中面臨的挑戰

盡管CAR-NK細胞在腫瘤過繼免疫治療中發揮著重要的作用,但其在臨床應用中面臨的挑戰也不容忽視。①潛在的致瘤性及EB病毒易感性：由于NK-92細胞來源于非霍奇金淋巴瘤患者,為了保證臨床應用的安全性,NK-92細胞系的過繼免疫治療必須經過輻照才能使用［28］。NK-92細胞系在使用前務必進行滅活的這一特點也限制了NK細胞在體內的擴增和生存［29］。②生存期短：目前,CAR-NK細胞臨床應用的挑戰主要是生存期短,因此臨床使用需要頻繁注射［30－31］。能夠盡快獲得足夠的NK細胞用于過繼性治療是免疫療法中令人關注的問題。使用細胞因子來擴展人NK細胞是最常用的方法之一。IL-2是刺激NK細胞增殖和激活的細胞因子,其通常需要2～3周。結果表明,經免疫磁珠純化的CD56+NK細胞在體外可以被IL-2激活12天［32］。雖然存活時間增加了,但是NK細胞的數量仍然不能滿足CAR-NK細胞的治療需求。③CAR載體的轉染難點：限制CARNK細胞批量生產的限制性條件主要為NK細胞轉染效率,目前使用的轉染方法主要分病毒轉染和非病毒轉染這兩種類型,而逆轉錄病毒和慢病毒轉染體系又是最常用的病毒轉染系統［33］。病毒載體能夠保證穩定的轉基因表達并被修飾基因技術編輯,如規律成簇間隔短回文重復(CRISPR)作為第一個用于遺傳的病毒載體修飾 NK細胞,其轉導效果達到了93%［32］。逆轉錄病毒載體轉導需要細胞分裂,慢病毒載體可以在不分裂的細胞中實現轉導而不改變細胞功能、表型和增殖能力。然而,慢病毒轉導后NK細胞的生存能力可能會受損,因此有時需要多個轉導后才能達到目標療效。為了克服個體間和實驗間的變異、插入突變的風險和細胞分裂的依賴性,可以通過電穿孔或脂質體實現轉染。電穿孔可以通過短的電脈沖在細胞膜上產生小孔,從而形成“隧道”轉移編碼材料,如DNA和RNA。雖然脫靶毒性的風險降低了,但與依賴病毒媒介的方法相比,DNA轉染的效果要差很多［34］。mRNA電穿孔后CAR的表達短暫,因此細胞毒性也是短暫的。所以,CAR-NK細胞的轉導方法仍需進一步改進,也有必要對用于NK細胞的CAR結構進行篩選和優化。

5 總結

NK細胞是機體重要的免疫細胞,不僅與抗病毒感染、免疫調節、超敏反應和自身免疫性疾病的發生有關,而且在腫瘤治療中發揮著重要的作用,其能夠識別并殺傷腫瘤細胞。免疫治療正在迅速發展成為癌癥治療的“第五支柱”,越來越多地與外科療法、化療、放療和靶向治療等癌癥治療聯合使用。雖然CAR-NK細胞現在面臨的轉染難點以及潛在病毒感染性帶來的巨大挑戰,仍需要大量的研究。但是在腫瘤的過繼免疫治療中,NK細胞及CAR-NK細胞由于本身所具有的獨特的免疫識別和殺傷機制的特點,將其批量化生產并應用于臨床的腫瘤治療即將會獲得非常顯著的療效。