三陰性乳腺癌與免疫檢查點抑制療法的最新研究進展

馮欣源，鐘少正，史 月，王海宇，趙潤生，劉 偉 (河北醫科大學基礎醫學院免疫教研室,河北石家莊050017)

1 三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancers，TNBCs）與 BRCA-1突變

1.1 TNBCsTNBCs是一種雌激素受體(estrogen receptor,ER)、孕激素受體(progestrone receptor,PR)、表皮生長因子受體2(epidermal growth factor receptor-2,HER2)均呈陰性的乳腺癌,占乳腺癌病例總數的10%～24%。TNBCs通常比其他亞型的乳腺癌更有侵略性,發病較早,容易復發和轉移,預后極差［1］。與普通乳腺癌不同,TNBCs對于現在的HER2靶向治療有耐藥性,化療仍是最有效的方法,但是其長期臨床效果并不理想,預后差,復發率高［2］。此外,還有一部分使用PARP抑制劑進行治療,由于缺乏依賴DNA的同源重組修復,PARP抑制劑通過抑制腫瘤單鏈DNA修復,導致腫瘤細胞中受損DNA的積累,從而誘導細胞凋亡［3］。

1.2 BRCA-1突變TNBCs與BRCA-1基因突變密切相關。BRCA-1定位于17q21,全長100 kb,為常染色體顯性遺傳,外顯率很高。通過修復同源DNA雙鏈斷裂和交聯損傷起作用,或是在DNA無法修復的時候使細胞凋亡［1,4］。由BRCA-1突變引起的TNBCs占到總數的70%［5］,其中非沉默突變(錯義突變,插入,缺失)相對較多［3］。突變的BRCA-1基因失去了其正常的生理功能,使細胞內發生錯誤的非同源重組,導致了疾病進展。BRCA-1突變引起了細胞內各種分子水平的變化,其中某些抑癌基因如Rb/P16,TP53功能障礙,多種miRNA的水平改變,以及NAD、PARP-1及其它基底標志物的變化。研究［6］表明在BRCA-1發生啟動子超甲基化和突變時,細胞中Rb(視網膜母細胞瘤易感基因)和p16(一種抑癌基因)也發生了功能障礙,并且伴隨著細胞內p53蛋白高表達,PTEN缺失,Ki-67水平升高,這說明TP53基因突變與 Rb/P16的功能障礙有協同作用。另外,在TNBCs中,BRCA突變引起了miRNA-200c的表達減少,細胞周期蛋白1(cyclin-D1,CCND1)基因和血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)基因是miRNA-200c的靶基因,miRNA-200c通過對靶基因的調控阻斷腫瘤血管的生長。同時另外兩種腫瘤抑制miRNA、let-7a和miR-335的表達也明顯下調,它們可以調節抑癌基因的活性。這兩者說明BRCA-1突變使miRNAs對其靶向基因的調節能力發生改變,從而導致 TNBCs 的發展［7］。 Li等［8］的研究表明,在 BRCA-1突變的TNBCs細胞中,NAD(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)水平升高,NAD依賴的PARP1(聚ADP核糖聚合酶)的水平及活性增加。這為BRCA-1突變引起的TNBCs治療提供了思路。另外研究證實在TNBCs中基底標志物CK5/6、CK17、EGFR、CK14 的表達增加,Kandula等［9］指出表達多個基底細胞角蛋白的腫瘤細胞更可能有一個功能失調的BRCA-1通路。通過這個特征可以鑒定TNBCs患者的 BRCA-1 基因狀態［1,9］。

2 TNBCs的免疫微環境

腫瘤微環境是指除腫瘤細胞本身以外,腫瘤細胞所處的周圍環境。腫瘤微環境是一個復雜的炎性環境,包括成纖維細胞、內皮細胞、血管平滑肌細胞等非免疫細胞以及T/B淋巴細胞、巨噬細胞、NK細胞、樹突狀細胞等免疫細胞和細胞因子網絡組成的免疫微環境。通過對TNBCs免疫微環境的研究,我們發現免疫微環境對于TNBCs的發生、生長和轉移起著雙重作用。各種腫瘤抗原的表達上調為免疫系統識別和腫瘤清除提供了前提。免疫微環境中腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor-infiltrating lymphocytes,TILs)起到對腫瘤細胞殺傷和清除的作用,但是免疫檢查點的高表達抑制了細胞免疫的功能,促進了腫瘤的免疫逃逸［10－11］。

2.1 免疫細胞

2.1.1 CD8+T細胞 在TNBC中,細胞毒性CD8+T淋巴細胞由腫瘤細胞上表達的MHCⅠ類分子激活,從而直接殺傷腫瘤細胞,并且釋放干擾素γ發揮抗腫瘤作用,與預后和患者的生存率密切相關［12］。

2.1.2 CD4+T細胞 在TNBs中,CD4+T淋巴細胞由MHCⅡ類分子激活后,基于腫瘤微環境中的細胞因子水平,可向不同方向分化為Th1、Th2、Th17和Treg等多種亞型,這些細胞具有調節B細胞、CD8+T細胞和巨噬細胞等的功能,從而發揮免疫系統的調節作用［13］。

2.1.3 Treg細胞 Treg細胞是具有免疫表型CD4、CD25、fox3p的CD4+T淋巴細胞亞群,Treg細胞在正常免疫環境中的作用是調節和抑制免疫反應,以防止自身免疫反應的發生。在TNBCs中,Treg細胞可以抑制其他效應細胞的作用,從而阻止機體對腫瘤的有效免疫反應［14］。

2.1.4 腫瘤相關巨噬細胞（tumour-associated macrophages，TAMs） TAMs分為兩類,一類稱為M1型巨噬細胞(經典化巨噬細胞),另一類為M2型巨噬細胞(替代活化巨噬細胞)。M1型巨噬細胞通過釋放促炎因子誘導Th1免疫應答,而M2型巨噬細胞通過產生IL-10和TGF-β抑制Th1免疫應答。TAMs發揮腫瘤抑制作用,但是研究證實高浸潤的TAMs與不良預后有關［15］。

2.1.5 TILs TILs是浸潤在腫瘤局部的淋巴細胞。正常乳腺組織不存在免疫細胞聚集的現象,但TNBCs腫瘤和基質顯示更高水平的免疫細胞浸潤［12,16］。TNBCs為低分化腫瘤,因此與其他 HER2-乳腺癌亞型相比,可能含有更多的抗原性腫瘤變異［17］。TNBCs特征性表現為邊緣推進,中央壞死,基質含量少。這些特征與TNBCs中高水平的TILs相關,即細胞核分級較高,伴有的原位成分較少。TILs增加與ER、PR表達呈負相關,與細胞毒性治療效果和預后呈正相關,同時與病理完全反應率、病理完全緩解率以及患者存活率呈正相關［18］。所以TILs被認為是TNBCs的預后因素。

三級淋巴組織(tertiary lymphoid structure,TLSs)是TILs的主要來源之一。近日,TLSs的存在已在包括乳腺癌、卵巢癌、腎細胞癌和惡性黑色素瘤等實體器官腫瘤中被確認。TLSs是以高內皮小靜脈(high endothelials venules,HEV)為特征的淋巴聚集性異位淋巴結樣結構,可存在于炎癥部位和腫瘤組織中。鄰近組織中的生發中心和大量的TLSs與較高水平的TILs密切相關。 此外,TLS的水平與 CD3－、CD8－、CD20+細胞密度和HEV的密度顯著相關。HEV是由立方形內皮細胞特化構成的血管,其內皮細胞表達外圍節點地址素(peripheral node addressin,PNAd),PNAd配體在淋巴細胞中表達。因此,PNAd在HEV中的表達有助于淋巴細胞從血管向組織的外滲,并促進TILs的形成,從而促進抗腫瘤免疫。由于HEV有助于TILs的浸潤,因此提出了腫瘤免疫治療的方法,即通過改變內皮細胞的特性來增加免疫細胞的浸潤。此外,研究［12,18］認為,高密度HEV乳腺癌患者的無病生存期明顯長于低密度HEV患者。

Loi等［19］首次證明,腫瘤和基質層內TIL每增加10%,就會分別降低27%和17%的死亡風險。Loi等后來在研究中證實了這些結果,還發現大量的TILs是遠處復發的重要預測因素,TILs每增加10%,遠處復發的相對危險度降低13%。單因素和多因素分析中,外周 TILs(危險比［hr］：0.95；95%置信區間［CI］：0.91～1.00；P＝ 0.0354)(HR：0.95；95%CI：0.91～1.00；P＝.0314)與較好的總生存期(overall survival,OS)和無病生存期(disease-free survival,DFS)顯著相關,提示TILs的分布在TNBC中可能有重要意義。TILs的水平也可以預測新輔助化療(Nac)的療效［14,20］。

2.2 TNBCs免疫微環境中 PD-1/PD-L1、CTLA-4水平免疫檢查點是指對于免疫進行負性調節的一組因子。正常情況下,免疫檢查點對于維持自身免疫耐受,避免免疫系統對正常組織進行攻擊發揮著至關重要的作用。在TNBC的腫瘤微環境中,主要表達的免疫檢查點是 PD-1/PD-L1 以及 CTLA-4［21］。

2.2.1 免疫微環境中的PD-1水平 PD-1是一種免疫檢查點,由活化的淋巴細胞(T/B細胞、自然殺傷細胞、單核細胞、樹突狀細胞、髓樣細胞、胸腺細胞)表達,參與維持自身免疫耐受［22］。在TNBCs的免疫微環境中,PD-1的水平增加［23］。PD-1的表達受 T細胞活性的影響,并可抑制T細胞活性,減弱T細胞共刺激信號傳導［24］。 且 Alsaab 等［24］研究發現,在CD3和TGF-β存在下,Treg細胞的PD-1受體促進了原始CD4+T細胞向Treg細胞的再轉化,從而減弱免疫反應。這種轉化通過抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)-Akt信號級聯反應來增加CD4+T細胞的Treg表達和免疫抑制功能。因此,PD-1的表達不僅抑制了效應T細胞的功能,而且增加了免疫抑制Treg細胞的轉化。此外,PD-1激活的Toll樣受體9(TLR 9)激動劑可顯著促進B細胞的成熟。提示PD-1在抑制B細胞介導的T細胞活化中起著重要作用［24］。

2.2.2 免疫微環境中的PD-L1水平 PD-L1代表程序性死亡配體1,是免疫球蛋白超家族負性刺激分子中參與免疫調節過程的重要成員。在T/B細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞、間充質干細胞、肥大細胞、腫瘤內皮細胞和上皮細胞中表達［25－26］。值得注意的是,PD-L1在腫瘤細胞上也有表達［27］。當主要組織相容性復合物(major histocompatibility complex,MHC)向T細胞提供腫瘤特異性抗原(tumour specific antigen,TSA)時,PD-L1與位于T細胞上的受體PD-1或CD 80(B7-1)結合,向T細胞傳遞抑制信號,CD80(B7-1)與腫瘤細胞的PD-L1相互作用,形成效應T細胞活化的負調節［13］。由于CD8+T細胞的衰竭,導致腫瘤細胞侵略性增加,分泌多種促炎細胞因子,如腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素 2(IL-2) 和干擾素 γ(interferon-γ,IFN-γ)［24］。在BRCA-2突變攜帶者TNBCs也觀察到了其中小部分的腫瘤細胞和間質細胞也表達PD-L1［27］。此外,PD-L1的表達似乎不是由淋巴免疫細胞直接觸發的,相反,有證據［28］表明PD-L1的表達受到多種替代機制的調控,其中包括信號通路、轉錄因子、表觀遺傳因子和miRNAs的活性。如：在乳腺癌中常見PI3K/Akt通路中的分子損傷,其中磷酸酶和張力素同源物(Pten)的下調或缺失是導致PD-L1表達上調的原因之一。另一方面,PD-L1在腫瘤細胞和造血細胞中的表達是通過刺激促炎細胞因子,如IFN-γ和TNF-α來確定的。活化的T細胞或NK細胞釋放的IFN-γ可誘導PD-L1的表達,反之,腫瘤細胞的PD-L1表達可進一步抑制T細胞浸潤和IFN-γ釋放,從而導致PD-L1表達減少［24］。總的來說,PD-L1表達的調控并不是受單一因素的影響,而是由多種因素共同調控［28］。

2.2.3 免疫微環境中的CTLA-4水平 CTLA-4屬于免疫球蛋白超家族,是一種對抗免疫系統的T細胞表面蛋白。CTLA-4抑制CD8+T細胞,減少Foxp3+調節T細胞,抑制調節性T細胞的作用。CTLA-4可在腫瘤細胞中被檢測到,可能在非激活階段抑制抗腫瘤免疫應答［28］。CTLA-4在淋巴組織中的幼稚T細胞早期激活時起作用,其通常在幼稚效應T細胞和調節性T細胞(Tregs)表面低水平表達,可能促進Treg活性。CTLA-4是CD28的同源物,與CD28有兩個配體CD80-(B7-1)和CD86(B7-2)。 CD80/CD86-CTLA-4存在于免疫突觸中,也存在于免疫微環境中。CD28與抗原提呈細胞(antigen presenting cell,APC)上的CD80/CD86受體結合,介導T細胞的激活,而配體CD80/CD86對CTLA-4的親和力明顯高于CD28。因此,當兩個受體在細胞表面同時表達時,CTLA-4介導的抑制信號更受“青睞”。這樣的競爭性結合破壞了 CD28 與 CD80 結合所介導的共刺激信號［13,28－29］。CTLA-4的主要異構體為具有細胞外配體結合域和細胞內信號轉導域的全長異構體。在TCR介入后,通過CD8+T細胞和CD4+T細胞(包括Tregs)刺激幼稚T細胞,使CTLA-4表達上調,CTLA-4通過其免疫受體酪氨酸基抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif,ITIM)與TCR結合,通過細胞內信號轉導域啟動抑制信號,從而造成細胞周期阻滯,抑制IL-2的分泌和T細胞的增殖,這主要發生在淋巴結內的啟動階段。當T細胞活化時,細胞內鈣水平升高,含有合成前可溶性CTLA-4的分泌顆粒被轉運到免疫突觸內的中央超分子激活團(Csmac)中,在免疫突觸內合成并釋放可溶性CTLA-4,而可溶性CTLA-4與b7相互作用,將CD 28排除在中央超分子激活團之外,這減弱了T細胞參與的反應,并防止自身反應性T 細胞的擴散［29－30］。

2.3 TNBCs免疫微環境中腫瘤抗原的水平TNBCs腫瘤微環境中腫瘤抗原主要被分為五類：組織分化抗原,突變抗原,病毒抗原,表觀遺傳改變后優先表達于腫瘤的抗原,非轉換細胞產生的抗原,例如血管細胞和成纖維細胞［31］。以下幾種腫瘤抗原在TNBCs腫瘤微環境中表達水平上調。MUC1是一種表達于導管上皮細胞高度糖基化的Ⅰ型跨膜粘蛋白,MUC1起著影響mRNA的穩定性,上調翻譯,減少先天免疫刺激,調節轉錄的作用［32］。DEPDC-1為一種含有DEP結構域的蛋白質,DEPDC-1可能起抑制腫瘤細胞生長,活化抗凋亡通路和調節有絲分裂的作用［33］。NCL是一種多功能蛋白質,定位于正常細胞的細胞核,NCL涉及核糖體的形成,參與新陳代謝,促進miRNAs和rRNA的成熟,從而參與乳腺癌的發生,轉移和耐藥［34］。Brachyury是由T基因編碼的T-box轉錄因子家族中的重要成員,是一種序列特異性DNA結合蛋白,Brachyury可以促進腫瘤細胞的轉移,腫瘤細胞免疫逃逸,誘導上皮間質轉化［35］。

3 TNBCs的免疫檢查點抑制療法

3.1 TNBCs免疫檢查點抑制療法的特點研究［36－37］發現,對TNBCs采用免疫檢查點抑制治療后,會產生效果明顯的抗腫瘤免疫反應。BRCA-1突變的TNBCs與其他類型的乳腺癌相比,可產生更多能夠激活機體免疫反應的腫瘤抗原,另外,在TNBCs腫瘤微環境中還存在更高水平的TILs浸潤。而TNBCs腫瘤微環境中大量表達的PD-1/PD-L1以及CTLA-4等免疫檢查點抑制了TNBCs患者體內激活抗腫瘤免疫反應的巨大潛力,當PD-1/PD-L1和CTLA-4等免疫檢查點被抑制時,機體免疫系統將被激活,產生有效的抗腫瘤免疫反應。研究還發現,給予TNBCs患者免疫檢查點抑制治療聯合傳統順鉑化療的治療方案,將取得更好的抗腫瘤效應［27］。

3.2 療效以及不良反應如今治療TNBCs僅可采用傳統化療。由于自身代謝的影響,TNBCs的患者在經過外科手術治療、化學藥物治療以及放射性治療后,仍存在較高的復發風險。Khosravi-Shahi等［38］發現,在現階段眾多的免疫療法當中,免疫檢查點抑制治療對多種惡性腫瘤具有較好的抗腫瘤作用。在TNBCs免疫微環境中,存在著大量的TILs浸潤,這標志著TNBCs對于免疫檢查點抑制治療具有良好的反應性。有研究［39］指出,運用免疫檢查點抑制療法就是增強機體自身的抗腫瘤免疫功能,將其由抑制狀態轉變為激活狀態。Weber等［40］的研究表明,與使用傳統化療藥物治療TNBC相比,使用PD-1免疫檢查點抑制治療組患者的緩解率更高。有研究［41－42］通過對TNBCs的分析發現,使用PD-1/PD-L1抗體的單抗原反應比例較低,例如在臨床試驗atezolizumab 1b中為26%,Javelin phase 1b中為8.6%,因此急需提高PD-1/PD-L1抑制療法的有效性。Li等［43］的研究提出了新的觀點,PD-L1分子上存在糖基化位點,該位點可決定PD-1與PD-L1的相互作用,進而抑制T細胞的活性。抗體藥物可通過與PD-L1上的糖基化位點結合從而抑制其功能,另外,特異性的糖基化抗體能夠有效促進PD-L1進入細胞內。這將是一種以PD-1和PD-L1的糖基化位點為靶向的治療策略,在TNBC模型中能夠有效增強抗腫瘤免疫效應。Nanda等［44］通過Ⅰ期臨床試驗：KEYNOTE-012證明運用單抗抑制免疫檢查點PD-1和PD-L1的治療方法對TNBC患者有效,其腫瘤總體反應率(overall response rate,ORR)為18.5%。同時指出,雖然免疫檢查點抑制藥物有著較好的耐受性,但同時也會引發與免疫相關的特異性不良反應。Hartkopf等［45］的研究表明,運用PD-1/PD-L1免疫檢查點抑制治療通常會導致患者體內自身免疫紊亂,具體機制并不明確,還需要更多的臨床研究去驗證。自身免疫機制的紊亂可能對各個器官系統的正常生理功能產生影響,常見于皮膚、胃腸道、肝臟、內分泌和呼吸系統。其他較少的不良反應為眼色素層炎、胰腺炎、血液病、神經性疾病以及腎炎。最常見的不良反應為軀干以及四肢皮膚的紅斑或者丘疹。

4 結語

免疫檢查點的靶向治療能夠對TNBCs起到明確的抗腫瘤作用,將有望顯著改善TNBCs患者的預后。最新的研究發現,運用輔助療法增強免疫檢查點靶向治療效應可能會是免疫檢查點抑制療法未來的發展方向。研究表明,用藥時間對免疫療法的效果起到至關重要的作用,在TNBCs的不同分期給予免疫檢查點抑制療法所產生的抗腫瘤作用有何不同還有待進一步的研究。此外,當前免疫檢查點抑制療法的運用仍停留于臨床研究階段,還有很多亟待解決的問題,如最佳劑量、時間安排、組合方法、應答標準和免疫治療的生物標志物等。因此,針對TNBCs的免疫檢查點抑制療法還需要更多深入的臨床研究。