液質聯用技術在化學藥雜質譜研究中的應用

許曉輝，劉建飛，黨子龍，趙 波，慕 偉，張生萍

（1蘭州市食品藥品檢驗所，甘肅 蘭州730050；2中國科學院蘭州化學物理研究所，西北特色植物資源化學重點實驗室，3蘭州大學第一醫院藥劑科，甘肅蘭州730000）

0 引言

液質聯用全稱為液相色譜?質譜聯用技術，它以液相色譜作為分離系統，質譜為檢測系統，被測樣品經流動相分離后，進入質譜系統被離子化，經質譜的質量分析器將碎片離子按質量數分開，經檢測器得到質譜圖。其優勢是分析范圍廣，定性結果可靠，檢測限低，分析時間短。液質聯用中常用的質譜包括四級桿、三重四級桿、離子阱、四級桿?飛行時間質譜、傅里葉變換質譜等。其結合了色譜對復雜樣品的高分離能力與質譜的高選擇性、高靈敏度及能夠提供相對分子質量與結構信息的優點，實現了色譜與質譜的優勢互補。液質聯用能夠推斷藥物中雜質的結構［1］，確證同分異構體雜質［2］，確認差向異構體雜質［3］，同時能夠快速發現藥物中的痕量雜質，在化學藥雜質研究中被廣泛應用。人用藥品注冊技術要求國際協調會（International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmamceuticals for Human Use，ICH）制定了一些雜質研究指導原則，這些指導原則有《原料藥、制劑雜質研究指導原則》、《殘留溶劑研究指導原則》、《元素雜質研究指導原則》。《美國藥典》、《歐洲藥典》、《英國藥典》均在附錄中設有雜質檢查通則，現行版《中國藥典》2015年版第四部也收載了《藥品雜質分析指導原則》，并且在2005年我國也頒布了《化學藥物質量控制方法驗證技術指導原則》［4］，這些指導原則對雜質分析及毒理學評價做了宏觀上的技術規范［5］。而雜質譜研究強調對雜質研究與控制的全面性、整體性，對各個雜質明確其來源、結構、含量以及生物活性等，根據以上信息制定合理的限度。本文探討了基于液質聯用技術的化學藥雜質譜研究，以期為雜質譜研究提供參考。

1 化學藥雜質譜控制

化學藥品中的雜質與藥品的安全息息相關，少數情況下，雜質也與藥品效能有關，化學藥品的雜質不可能完全消除，但是當雜質達到一定量時便會產生毒副作用，對人體健康造成損害，因此必須在總體水平上對化學藥品中的雜質進行確切評價，明確其來源、成分結構、毒副作用及其限量，以保證臨床用藥安全有效，保障人民生命健康安全。雜質的來源主要包括［6］：藥品生產過程中使用的溶劑、催化劑；藥物合成過程中反應不完全而遺留的反應原料，初始反應物，合成中間體、合成副產物，合成過程中產生的相關物質；藥品貯存、運輸過程中的氧化、水解、分解產物；手性化合物中的光學異構體；藥物的多晶型；使用的金屬工具或不耐酸、不耐堿的器皿引入的重金屬及無機鹽。化學藥品雜質控制是化學藥品研發、生產工作的重要組成部分，常見的雜質控制方法分為定性和定量方法。定性方法主要有熔點、TLC、旋光度、HPLC、HPLC?MS、NMR 等；定量方法主要有容量法、HPLC、GC、UV、IR、HPCE、HPLC?MS 等。 追溯雜質控制理念的變遷，可分為三個階段：純度控制階段、限度控制階段和雜質譜控制階段。早期的雜質控制主要依靠化學分析方法，如容量法、分光光度法。后來，隨著色譜技術及其他檢測技術的發展與應用，色譜技術或者色譜技術與其他技術聯用成為化學藥雜質控制分析的重要分析方法，同時藥品雜質控制是在雜質生物學特性的基礎上得到的雜質限量［7］。雜質譜控制是雜質控制的一個總體原則，包括藥品中所有雜質的種類、來源、含量及結構等信息，通過雜質譜分析能夠較為全面地掌握藥品中雜質的種類、來源、含量、結構，根據特定雜質選擇合適的分析方法，確保雜質能夠有效檢出與定量，同時根據雜質安全性試驗或臨床試驗結構評估雜質可接受水平，它強調結合具體工藝與產品特點以及綜合藥學、藥理毒理、臨床研究結果對藥品中所存在的雜質進行全面地控制，從而保證藥品質量的安全性［5］。

2 基于液質聯用的化學藥雜質譜研究思路

雜質研究是貫穿于藥品研發始終的一項重要內容。雜質譜分析是藥品質量控制的重要工作。基于雜質譜分析的雜質控制是“質量源于設計”的基本理念在雜質研究與控制中的一種具體實踐［8］。應用各國藥典及相關的雜質研究技術指導原則在具體雜質譜研究過程中，應充分體現雜質的源頭控制、過程控制、終點控制理念，根據藥品生產過程中的原料、輔料、工藝等要素，探究藥物制劑中可能存在的雜質，并對雜質結構進行確證，根據毒理實驗和藥品安全進行雜質限度確認［9］。國家藥品審評中心（center for drug evaluation，CDE）要求新藥、仿制藥申報時，必須提供雜質譜研究資料。在通用技術文件（common techni?cal document，CTD）中，整體性雜質研究方面，要求申報單位必須包含以下內容：產品中可能存在的雜質及來源；對已知雜質能給出結構并提供結構確證圖譜；雜質名稱、結構、來源、控制限度以及是否定入質量標準。基于液質聯用的化學藥雜質譜研究，應不僅能檢出樣品中已有的雜質，還能有效檢出潛在的雜質，并能對雜質進行定性，最終根據不同雜質的來源及生物活性、毒理等方面特性制定相應的質控限度。

2.1 基于雜質研究方面的文獻資料調研 雜質前期研究的信息獲取主要是文獻資料調研，主要的文獻資料有美國食品藥品監督管理局（The Food and Drug Administration，FDA），歐洲藥品管理局（European Medicines Agency，EMA），日本醫藥品醫療器械綜合機構（Pharmaceuticals and Medical Divices Agency，PMDA）公開的資料、專利和文章。一般是從原料藥合成路線、主藥的理化性質、穩定性影響因素、主藥雜質產生的原因及主要的降解產物、處方條件和生產工藝、輔料是否影響主要成分的穩定性等方面進行詳細的文獻調研，理論的調研為其后的整體性、全面性實踐研究提供指導。

2.2 基于合成路線進行工藝雜質的分析 藥物在合成過程中，運用起始原料、催化劑反應得到中間體，也可能會產生副產物，由中間體與下一個原料反應，得到第二個中間體，直至得到目標化合物。不同的反應會引入不同的雜質，或者原料在反應過程中反應不完全的起始原料、催化劑、起始原料的降解產物、殘留溶劑等，在分離過程中，沒有全部分離干凈，便會帶入到原料藥中，而用原料藥制備藥物制劑時，這些雜質又會被帶入藥品中。由于這類雜質與藥品活性成分有淵源關系，因此也通常稱為有關物質，除了降解產物，這些雜質也叫工藝雜質。分析這一類雜質，首先得理解合成反應機理，結合合成路線推測工藝雜質的來源［10］，同時要注意雜質的來源與去向，重點關注可能引入的潛在雜質，由于這類雜質與主成分的結構相似，因此其質譜裂解規律與主成分也有相似之處［11］。

2.3 基于結構特征可能產生的降解產物 一個特定結構的藥物，其對應的化學性質行為在一定的外界條件下降解途徑是固定的，如穩定性較差或在生產制備過程中容易降解的主藥成分，這類雜質通常通過穩定性試驗和強降解試驗手段來確認雜質，所謂強降解，即將供試品用高溫、高濕、強光照射、酸水解、堿水解以及氧化的方法進行破壞，以考察破壞前后雜質變化的基本情況。相對于穩定性試驗，強降解試驗能夠在短時間內獲得大量的信息，這類信息主要有降解途徑和降解產物，其為藥品包裝材料和儲藏條件提供依據，反過來，也指導藥品的生產環節。

2.4 基于處方工藝可能引入的雜質 處方中涉及輔料有助懸劑、黏合劑、崩解劑、填充劑、著色劑、甜味劑等，在運用原料藥和輔料制備藥物制劑的過程中，活性成分、輔料在生產過程以及保存條件下的相容性是處方工藝研究的重要內容。如果選擇輔料不慎，也可能加速藥物的降解致使藥物雜質增多而影響用藥安全。有時，輔料對于產品質量的影響要比想象的更加嚴重。另外，某些多晶型的藥物，晶型不穩定，在生產過程中，晶型會發生變化，導致藥物主成分變質，藥效活性降低［12］。

2.5 液質聯用分析方法的驗證及雜質限度 液質聯用定性定量過程中，影響測定方法的不確定度是多方面的［13］。雜質譜分析方法驗證的目的是驗證所采用的分析方法是否適合相應的定性定量要求。驗證項目包括精密度、準確度、檢測限、定量限、專屬性、線性與范圍、耐用性、系統適用性、溶液穩定性。一般用于限度試驗的方法驗證側重專屬性和檢測限，用于定量試驗的方法驗證強調專屬性、準確度和定量限［14］。人用藥物注冊技術要求ICH對于每日最大劑量≤2 g的原料藥，雜質報告限度為 0.05%，鑒定限度為0.10%，控制限度為0.15% ；對每日最大劑量＞2 g的原料藥，雜質報告限度為0.03%，鑒定限度為0.05%，控制限度為 0.05%［15］。化學藥物制劑質控限度，每日最大劑量≤10 mg，控制限度為1.0%，每日最大劑量介于10～100 mg，控制限度為0.5%，每日最大劑量為100 mg～2 g，控制限度為 0.2%，每日最大劑量＞2 g，控制限度為 0.15%［16］。 如果雜質含量高于ICH的質控限度，必須進行雜質安全性評價；如果雜質含量低于ICH的質控限度，首先進行構效關系研究，如沒有遺傳毒性警戒結構，符合ICH一般限度就可以，如有遺傳毒性結構，則應根據遺傳毒性試驗的結果確定雜質限度。

3 液質聯用在化學藥雜質譜研究中的應用進展

近幾年，液質聯用技術在化學藥雜質譜分析中的應用越來越廣泛，尤其是在原料藥和化學藥物制劑雜質譜分析中，對藥品中存在的已知雜質進行鑒別，對未知雜質進行結構推導，然后借助光譜、核磁共振等技術手段進行鑒定。如大環內酯類抗生素是臨床廣泛使用的一類藥物，其組分復雜，有關物質種類多且化學性質不穩定，極易產生雜質。王明娟等［17］采用串聯質譜法建立了大環內酯類抗生素雜質譜的研究思路，并解析了該類化合物的質譜裂解規律，闡述了基于液質聯用分析方法如何依據已知組分的質譜裂解規律推導未知化合物的結構。周長朋等［18］基于高效液相色譜?四極桿／線性離子阱質譜儀建立了測定鹽酸決奈達隆中兩種基因毒性雜質痕量殘留的分析方法，該方法利用線性離子阱的高分辨質譜并結合對照首次確證了鹽酸決奈達隆中的兩種導致基因毒性的雜質，有利于在鹽酸決奈達隆合成過程中對該類雜質進行控制。 楊昊等［19］用 HPLC?ESI?IT?MSn 法研究慶大霉素C1a的雜質譜，從慶大霉素C1a原料中檢出13種雜質，對其中12種雜質的結構進行了歸屬，結果顯示，慶大霉素C1a中含有慶大霉素A、B、西索米星、小諾霉素、威達米星或其同分異構體和同系物，并含有慶大霉素C1a和上述雜質的降解產物。Zhu等［20］采用LC?MS對多索茶堿藥物中未知雜質進行研究，推導出其化學結構，并用高分辨率質譜和1D和2D NMR數據證實了該結構。同時，他們還研究了色甘酸鈉藥物制劑中的相關物質和降解產物，基于質譜光譜數據和準確的質量測量，對2種未知雜質和6種未知降解產物的化學結構進行了表征，其中包括歐洲藥典中所列的不純C。此外，還提出了一種合理的降解產物形成機制［21］。 Kumar等［22］采用高效液相色譜法測定鹽酸異丙烯醇的含量，發現了一種未知雜質，通過LC?MS分析推導這種未知雜質的化學結構，采用半制備液相從雜質富集的反應粗樣品中分離出這種雜質，經核磁共振（1H?NMR、13C?NMR、DEPT、HSQC）和紅外光譜（infrared spectroscopy，IR）確證了該雜質的化學結構。Yang等［23］采用液質方法確證了輔酶A生產過程產生及主藥降解物產生的10種雜質，其中7種雜質是首次被發現的，作者對其中3種未知雜質進行了合成，并用NMR進行了鑒定。總之，液質聯用是組分復雜樣品和微量樣品分離分析的有力研究手段，其對樣品屬性沒有限制，樣品前處理方法簡單，無需化合物有紫外吸收，是化學藥雜質研究的主要方法之一［24］。

4 總結

藥品中雜質是否得到全面準確的控制直接關系到藥品的臨床用藥安全性。雜質譜分析強調雜質控制的系統性和整體性，通過雜質譜分析可以全面掌握雜質的種類、結構、來源和限量。雜質譜分析遵循“質量源于設計”，從雜質的來源入手，從合成路線工藝、化學結構、處方工藝等方面進行分析，探究藥物中可能存在的副產物、降解物、中間體、溶劑殘留、催化劑殘留等。雜質分析方法驗證應具有針對性和全面性，保證建立的方法能夠全面檢出潛在的雜質，防止出現雜質漏檢的情況。在應用液質聯用技術進行雜質譜研究時，不僅要根據目標化合物的分子量、基質、結構等優化質譜條件，更重要的是有豐富的質譜解析知識和經驗，能夠根據雜質的裂解情況、特征離子推斷雜質結構，并結合其他檢測方法對雜質進行鑒定。

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