白花前胡丙素對人肺癌A549細胞B7H3表達的調(diào)節(jié)作用

陳清閣 王雄彪(通訊作者)

（上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院呼吸科 上海 200062）

B7H3作為重要的抑制性共刺激分子，其高表達抑制了T細胞對腫瘤細胞的免疫活性，造成腫瘤細胞的免疫逃逸。B7H3的高表達與淋巴結轉(zhuǎn)移、TNM分期明顯相關，是一個重要的肺癌治療靶點。Pra-C是中藥前胡中重要提取物之一，本實驗通過檢測Pra-C對人肺癌A549細胞B7H3表達、基因水平的調(diào)節(jié)，探討Pra-C對共刺激分子B7H3的調(diào)節(jié)作用。

1.材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞來源及培養(yǎng) 人肺癌細胞A549由上海中國科學研究院細胞庫提供，常規(guī)培養(yǎng)于雙抗和10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)。

1.1.2 實驗試劑與儀器 RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco）；Pra-C（成都曼徹斯特）；雙熒光素酶檢測試劑盒（Promega）；B7H3引物與探針（閃晶），ABI7300全自動熒光定量PCR儀（美國ABI公司）等。

1.2 方法

1.2.1 流式細胞術 A549細胞以5×104個/孔接種于24孔板，加藥48h后分別收集于流式細胞管中，清洗后調(diào)整每管體積為50μL；加入B7H3-PE抗體5μL，4℃避光30min；加300μL D-Hanks緩沖液，上機。

1.2.2 Real-Time PCR 反應條件：94℃ 10min，94℃ 30s，60℃ 1min，40個循環(huán)，以GAPDH基因作為內(nèi)參，引物序列如下：B3H3-F5’-GTGGTGCTGGGTGCAAT-3’；B3H3-R5’-CCTCTGGGGGGAATGTCATA-3’；B3H3-probe 5’-GTGGTGCTGGGTGCAAT-3’；GAPDH-F 5’-CCACTCCTCCACCTTTGAC-3’；GAPDH–R5’-ACCCTGTTGCTGTAGCCA-3’；GAPDH-probe 5’-TTGCCCTCAACGACCACTTTGTC-3’

1.2.3 B7H3-PGL3報告基因的構建 設計人B7H3啟動子引物，B7H3-F5’-gcGGTACCCGGTTCCTCCCTTCATAGC-3’；B7H3-R CCTGAGTCCCAGAGTCG；擴增產(chǎn)物長度為1240bp，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，篩選克隆，測序結果正確后樣本質(zhì)粒提取。

1.2.4 熒光素酶實驗 將B7H3-PGL3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至A549細胞中，分為Pra-C40μmol/ml組、IFN-γ組、空白對照組，24小時后，GloMax20/20發(fā)光檢測儀檢測相對熒光強度。

1.3 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件，本實驗數(shù)據(jù)為計量資料，實驗數(shù)據(jù)以±s表示，采用SNK-q檢驗比較多組間差異，計量資料采用兩獨立樣本t檢驗比較兩組間差異，以P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2.結果

2.1 Pra-C可以下調(diào)A549細胞B7H3蛋白的表達

SNK-q檢驗不同處理組間A549細胞B7H3蛋白的表達差異，發(fā)現(xiàn)Pra-C濃度在40μmol/ml、20μmol/ml、10μmol/ml時B7H3蛋白的相對表達量分別為（0.235±0.01）（0.38±0.009）（0.43±0.004），其下調(diào)作用具有劑量依賴性，Pra-C濃度在40μmol/ml時與50ng/ml IFN-γ對A549細胞B7H3蛋白的下調(diào)作用無顯著差異（P=0.054）。

2.2 Pra-C可以下調(diào)A549細胞B7H3 mRNA的表達

Real-Time PCR結果顯示，40μmol/ml Pra-C組及50ng/ml IFN-γ組作用于A549細胞24h后均可顯著下調(diào)A549細胞B7H3 mRNA轉(zhuǎn)錄水平(分別是0.712±0.17，0.726±0.15，P=0.017,P=0.005)，且兩組之間無顯著差異，（t=-0.115，P=0.913）

2.3 Pra-C對B7H3-PGL3-promoter熒光報告基因的調(diào)節(jié)

熒光素酶實驗結果顯示不同處理組B7H3相對熒光強度：40μmol/ml 與IFN-γ組均可顯著下調(diào)A549細胞B7H3啟動子轉(zhuǎn) 錄（ 分 別 是 0.236±0.15，0.257±0.002，P＜0.001）， 且Pra-C與INF-γ對B7H3的調(diào)節(jié)作用無顯著差異（t=-2.628，P=0.054）。

3.討論

肺癌是當今全世界發(fā)生率和死亡率最高的惡性腫瘤。由APC細胞表面的多種共刺激分子與T細胞表面的相應受體結合，可以決定接受抗原刺激的T細胞是活化增殖，還是抑制甚至凋亡。B7H3作為重要的抑制性共刺激分子，其高表達抑制了T細胞對腫瘤細胞的免疫活性，造成腫瘤細胞的免疫逃逸，可成為肺癌治療的靶點。

已有研究顯示，50ng/ml IFN-γ可下調(diào)人肺癌細胞A549表面B7H3的表達。本研究用流式細胞學技術、RT-PCR技術、雙熒光素酶法分別檢測B7H3蛋白表達水平、轉(zhuǎn)錄水平及啟動子區(qū)的調(diào)節(jié)水平。結果顯示，當Pra-C濃度為40μmol/ml時下調(diào)作用最強，較50ng/ml IFN-γ無統(tǒng)計學差異。

Pra-C是前胡重要的香豆素類化合物提取物之一。前胡作為呼吸疾病常用藥物，具有降氣化痰、疏散風熱之功，探討Pra-C通過免疫調(diào)節(jié)作用發(fā)揮抗腫瘤療效對拓展中草藥前胡在抗腫瘤領域的思路有一定價值。

[1]劉一誠，戴彭辰，李慧英，騰柱國，何成詩.共刺激因子B7H3在非小細胞肺癌中的表達研究.現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2016,16(27):5309-531.

[2]趙建強，孫玉萍，王薇，等.B7H3分子在非小細胞肺癌中表達的研究.中國全科醫(yī)學，2008,11(1A):31-34.